Denne protokollen beskriver en metode for innsamling av tåreprøver ved hjelp av Schirmer-strimler og en integrert kvantitativ arbeidsflyt for å oppdage ikke-invasive tåreproteinbiomarkører. Arbeidsflyten for klargjøring av suspensjonsprøver muliggjør rask og robust fremstilling av tåreprøver og massespektrometrisk analyse, noe som resulterer i høyere peptidgjenvinningsutbytte og proteinidentifikasjon enn standard prosedyrer i løsningen.
Tårevæske er en av de lett tilgjengelige biofluidene som kan samles ikke-invasivt. Tåreproteomikk har potensial til å oppdage biomarkører for flere okulære sykdommer og tilstander. Suspensjonskolonnen for overlapping har blitt rapportert å være en effektiv og brukervennlig arbeidsflyt for prøveklargjøring for bred anvendelse av nedstrøms proteomisk analyse. Likevel har denne strategien ikke blitt godt studert i analysen av humant tåreproteom. Den nåværende protokollen beskriver en integrert arbeidsflyt fra kliniske humane tåreprøver til rensede peptider for ikke-invasiv tåreproteinbiomarkørforskning ved hjelp av massespektrometri, som gir innsikt i sykdomsbiomarkører og overvåking når kombinert med bioinformatikkanalyse. En proteinsuspensjonsfangstprøvepreparering ble påført og demonstrerte oppdagelsen av tåreproteom med raske, reproduserbare og brukervennlige prosedyrer, som et universelt, optimalisert prøvepreparat for human tårevæskeanalyse. Spesielt utkonkurrerte suspensjonsfangstprosedyren prøvepreparering i løsningen når det gjelder peptidgjenvinning, proteinidentifikasjon og kortere prøveprepareringstid.
Tåreproteomikk har fått oppmerksomhet for å utforske potensielle biomarkører for okulære sykdommer og tilstander 1,2,3,4,5,6, for å få tilgang til patogenesen av den okulære og systemiske tilstanden, samt å utnytte fordelen med ikke-invasiv tåreprøvesamling ved hjelp av Schirmer-strimler. Den teknologiske utviklingen av neste generasjons massespektrometri har muliggjort proteinkvantifisering i mikroliterskala tårer med nøyaktighet og presisjon som ikke var mulig tidligere. Prøveprepareringsmetoder er ennå ikke standardisert. En robust og standardisert arbeidsflyt for prøvepreparering er avgjørende for å lykkes med klinisk anvendelse i forskning på tåreproteinbiomarkører. Arbeidsflyten for prøvepreparering av suspensjonsfangst (S-Trap) ble nylig rapportert som en effektiv og sensitiv prøveprepareringsmetode for bred nedstrøms proteomisk analyse 7,8. Likevel har denne strategien ikke blitt godt rapportert i analysen av humant tåreproteom, utkonkurrert filterstøttet prøvepreparering (FASP) og fordøyelse i løsningen når det gjelder enzymatisk fordøyelseseffektivitet og større antall proteinidentifikasjon ved massespektrometrisk analyse9. Den S-Trap-baserte tilnærmingen ble demonstrert i fremstillingen av retinalt vev 10, formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) vev 11, celler 12, mikroorganisme 13 og flytende biopsier14,15.
Denne protokollen beskriver en integrert kvantitativ arbeidsflyt fra kliniske prøver til enzymatisk fordøyd protein for oppdagelsen av et ikke-invasivt tåreproteinbiomarkørpanel med en rask, reproduserbar og robust teknisk strategi. Kort fortalt ble tårevæske samlet opp ved hjelp av en standard Schirmer-strimmel og umiddelbart tørket med en oftalmisk rammevarmer for å forhindre proteinautolyse ved romtemperatur. Innebygde totale proteiner ble ekstrahert ved bruk av 5% natriumdodecylsulfat (SDS) lysisbuffer i henhold til produsentens forslag, etterfulgt av proteinanalysemåling. Det ekstraherte lysatet gjennomgikk deretter standard reduksjon med dithiothreitol (DTT) og alkylering med jodoacetamid (IAA).
Etter forsuring med fosforsyre ble suspensjonsfangstkolonneproteinutfellingsbuffer inneholdende 90 % metanol og 100 mM trietylammoniumbikarbonat (TEAB) tilsatt aggregerte proteiner. Prøven ble deretter overført til en ny suspensjonsfangstmikrokolonne. Enzymatisk fordøyelse med trypsin av sekvenseringsgrad i forholdet 1:25 (w/w, trypsin: protein) ved 47 °C i 1 time. De resulterende peptidene ble deretter eluert via sentrifugering, sekvensielt med 50 mM TEAB, 0,2 % vandig maursyre (FA) og 50 % acetonitril (ACN) inneholdende 0,2 % FA. De eluerte peptidene ble vakuumtørket og rekonstituert i 0,1 % FA. Peptidkonsentrasjonen ble målt og justert til 0,5 μg/μL for massespektrometrisk analyse.
For å oppnå nøyaktige resultater ved hjelp av denne metoden, bør strømfrie engangshansker brukes i alle prosedyrer fra riveprøveinnsamling for å unngå prøveforurensning. Det er viktig å unngå bobler og luftspalter mellom filteret og prøveløsningen i hvert trinn ved å bruke mikrospinnende kolonner. Hvis prøvevolumet er større enn kapasiteten til kolonnene, anbefales det å gjenta prosessen. Denne protokollen har vist seg å være mer effektiv enn den tradisjonelle protokollen i løsningen når det gjelder forberedelsestid, proteingjenoppretting og total proteinidentifikasjon. Dette skyldes i stor grad at prøvene gjennomgår de fleste av de nødvendige prosedyrene i samme kolonne, i motsetning til løsningsmetoden som involverer flere overføringstrinn som acetonutfelling, fordøyelse og opprydding (avsalting), noe som øker sannsynligheten for variasjoner i de resulterende dataene.
I tillegg til tåreprøvene samlet inn med mikrokapillærmetoden16,17, gir denne FASP-arbeidsflyten med suspensjonsfangende mikrokolonne en alternativ prøveprepareringsmetode som muliggjør rask og robust tåreprøvepreparering samlet inn ved hjelp av Schirmer-strimler, med minimal materialforberedelse og brukervennlige trinn å følge. Dette tillater reproduserbar tåreprøveforberedelse for store kohortstudier på tvers av flere okulære sykdommer eller tilstander med forbedret peptidutvinning og proteinidentifikasjon av MS over prosedyrer i løsningen. Denne pålitelige prosessen kan brukes regelmessig i utarbeidelsen av tårebiomarkørprøver for forskning og andre kliniske formål. Viktigst av alt, det krever minimal opplæring av personalet for innsamling på stedet og negerer behovet for prøvelagring i en fryser. Prøvene tørkes på stedet for å minimere proteinautolyse og nedbrytning. Derfor tillater dette praktisk forsendelse via post for å lette nedstrømsanalyse, i motsetning til å bruke mikrokapillærrør.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av InnoHK-initiativet og Hong Kong Special Administrative Region Government; Forskningssenter for SHARP Vision; og Research Centre for Chinese Medicine Innovation (RCMI) ved Hong Kong Polytechnic University.
9 mm Plastic Screw Thread Vials | Thermo Scientific | C4000-11 | |
Acetonitrile, LCMS Grade | Anaqua | AC-1026 | |
Centrifuge MiniSpin plus | Eppendorf | 5453000097 | |
DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra | Sigma-Aldrich | 43815 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
Formic acid, ACS reagent, ≥96% | Sigma-Aldrich | 695076 | |
Frame Heater OPTIMONSUN Electronic | Breitfeld & Schliekert GmbH | 1203166 | |
Iodoacetamide (IAA), BioUltra | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Methanol, HPLC Grade | Anaqua | MA-1292 | |
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 368632 | |
Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O | Sigma-Aldrich | 345245 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry | Sciex | TripleTOF 6600 | |
Schirmer Ophthalmic Strips | Entod Research Cell UK Ltd | I-DEW Tearstrips | |
S-Trap Micro Column | Protifi | C02-micro-80 | |
SureSTART 9 mm Screw Caps | Thermo Scientific | CHSC9-40 | |
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M | Sigma-Aldrich | 18597 | |
Ultra-performance Liquid Chromatography | Eksigent | NanoLC 400 | |
UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 |