一种快速、简单、标准化的均质化制备抗原/辅助乳剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎的方法

Summary

为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，一种多发性硬化症的动物模型，用含有自身抗原的油包水乳剂对小鼠进行免疫并完成弗氏佐剂。虽然存在用于制备这些乳液的几种方案，但本文介绍了一种用于乳液制备的快速、简单和标准化的均质化方案。

Abstract

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）与多发性硬化症（MS）具有相似的免疫学和临床特征，因此被广泛用作识别新药物靶点以更好地治疗患者的模型。MS 的特征是几种不同的病程：复发缓解型 MS （RRMS）、原发性进行性 MS （PPMS）、继发性进行性 MS （SPMS） 和罕见的进行性复发型 MS （PRMS）。虽然动物模型不能准确地模仿所有这些对比鲜明的人类疾病表型，但有一些EAE模型反映了MS的一些不同临床表现。例如，C57BL / 6J小鼠中髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导的EAE模仿人PPMS，而SJL / J小鼠中髓磷脂蛋白（PLP）诱导的EAE类似于RRMS。其他自身抗原，如髓鞘碱性蛋白（MBP）和许多不同的小鼠品系也用于研究EAE。为了在这些自身抗原免疫EAE模型中诱导疾病，制备油包水乳剂并皮下注射。大多数EAE模型还需要注射百日咳毒素才能发展疾病。为了获得一致且可重现的EAE诱导，需要详细的方案来制备试剂以产生抗原/佐剂乳剂。这里描述的方法利用标准化方法来生成油包水乳液。它简单快速，使用振荡均质机代替注射器来制备质量控制乳液。

Introduction

免疫耐受性的破坏可导致自身免疫性疾病的产生，例如多发性硬化症（MS）。据估计，全世界有280万人患有^MS1。尽管MS的确切原因在很大程度上仍未知，但自身反应性T细胞和B细胞的失调以及Treg功能的缺陷在该疾病的发病机制中起着重要作用^2，3。

自身免疫性疾病的动物模型是研究潜在治疗方式的重要工具。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型已被对MS⁴感兴趣的研究人员使用了近一个世纪。在早期的实验中，该疾病的发病率相对较低。引入含有 分枝杆菌 和百日咳毒素的完全弗氏佐剂（CFA）^{能够在小鼠中}一致地诱导EAE4。最重要的是，有必要将CFA与中枢神经系统（CNS）特异性抗原混合，以产生均匀的油包水乳液以诱导EAE。目前最常见的EAE模型是基于用致脑肽对小鼠进行主动免疫。小鼠的遗传背景在疾病易感性中起重要作用，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG_35-55）和髓鞘蛋白脂蛋白（PLP_139-151）肽分别用于诱导C57BL / 6J和SJL小鼠的EAE^，5。然而，也可以使用其他小鼠品系和CNS衍生的肽。

CFA/肽乳剂的质量是决定主动免疫EAE模型⁶中疾病外显率的关键因素。必须通过将溶解在水性缓冲液中的致脑肽与CFA混合来制备均匀的油包水乳液，否则动物不会患上这种疾病。关于CFA/肽乳液的制备已经发表了许多方案。实例包括使用涡旋⁷、超声^处理8、注射器和三通T连接器⁹、或仅使用一个注射器⁵。然而，所有这些方法都难以标准化，并且通常与冗长而复杂的协议相关联。

与上述所有方法相比，此处描述的用于乳液制备的简单方法具有人与人之间没有差异且相对较快的优点。乳液由均质机以设定的速度、时间和温度摇动试剂产生，确保快速一致的结果。除了在EAE模型中诱导疾病外，该方法还可用于研究其他自身免疫性疾病模型，例如胶原蛋白诱导的关节炎（CIA）和抗原诱导的关节炎（AIA）⁶。因此，预计该方法可用于在依赖于含有自身抗原的油包水乳剂的其他动物模型中持续诱导疾病，例如实验性自身免疫性神经炎（EAN）¹⁰，实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）11，自身免疫性葡萄膜炎（EAU）¹²和重症肌无力（MG）¹³。该方法还持续诱导一般免疫反应，例如延迟型超敏反应（DTH）⁶，因此可用于提供癌症和疟疾疫苗（见讨论）。

因此，已经开发了一种快速（总制备时间~30分钟），简单（所有试剂都可以提前制备并储存）和标准化（使用振荡均质器完成乳液）的方法，并在此介绍。使用该协议制备的CFA /抗原乳剂在自身免疫动物模型中始终诱导疾病。

Protocol

所有动物程序均按照瑞典动物研究委员会的惯例进行，并得到瑞典隆德-马尔默动物伦理委员会的批准（许可证号：M126-16）。 注意：该方法的示意图如图 1所示。 1. 材料准备 注意：将所有试剂无菌准备在无菌罩中，并等分并储存在指定的温度下。试剂可以储存长达 2 年而不会失去其效果。 ?…

Representative Results

用于制备CFA/MOG乳液的快速、简单和标准化方案如图 1所示。这种方法最近在别处有描述6.CFA / MOG乳液也可以用其他方法制备，例如传统的注射器方法或通过涡旋法制备。这里通过评估乳液的质量来比较这些方法。所有方法都生产油包水乳液;通过在载玻片上加入一小滴，然后在相差显微镜下观察来评估这些乳液的均匀性和质量。通过振荡均质法生产的乳液显?…

Discussion

油包水乳剂，如抗原/弗氏佐剂，已被用于诱导EAE¹⁷超过半个世纪。目前还没有独立于人类影响的抗原乳剂制备标准化方法。使用注射器手动混合是大多数实验室的标准，但是这种方法非常耗时，通常会导致材料过度损失，并且质量因制备它的科学家而异。

本手稿中介绍的方法使用标准振荡均质机制备抗原/CFA 乳剂。此外，这里使用的所有试剂都可以等分并长…

Materials

1 mL Injection syringe	B. Braun	9166017V
1 mL Injection syringe	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml empty tubes with caps	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P2980	Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Store at RT
Emulsion kit	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store at +4 °C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast Microscope	Olympus	BX40-B
Steel Beads 3.2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave and store at RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store at RT