En hurtig, enkel og standardiseret homogeniseringsmetode til fremstilling af antigen / adjuvansemulsioner til inducering af eksperimentel autoimmun encephalomyelitis
Summary
For at inducere eksperimentel autoimmun encephalomyelitis, en dyremodel af multipel sklerose, immuniseres mus med en vand-i-olie-emulsion indeholdende et autoantigen og fuldender Freunds adjuvans. Mens der findes flere protokoller til fremstilling af disse emulsioner, præsenteres en hurtig, enkel og standardiseret homogeniseringsprotokol til emulsionsforberedelse her.
Abstract
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) deler lignende immunologiske og kliniske træk med multipel sklerose (MS) og bruges derfor i vid udstrækning som en model til at identificere nye lægemiddelmål for bedre patientbehandling. MS er kendetegnet ved flere forskellige sygdomsforløb: recidiverende-remitterende MS (RRMS), primær progressiv MS (PPMS), sekundær progressiv MS (SPMS) og en sjælden progressiv-recidiverende form for MS (PRMS). Selvom dyremodeller ikke nøjagtigt efterligner alle disse kontrasterende humane sygdomsfænotyper, er der EAE-modeller, der afspejler nogle af de forskellige kliniske manifestationer af MS. For eksempel efterligner myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG) -induceret EAE i C57BL / 6J mus human PPMS, mens myelin proteolipidprotein (PLP) -induceret EAE i SJL / J mus ligner RRMS. Andre autoantigener, såsom myelin basisk protein (MBP), og en række forskellige musestammer bruges også til at studere EAE. For at fremkalde sygdom i disse autoantigenimmuniserings EAE-modeller fremstilles en vand-i-olie-emulsion og injiceres subkutant. De fleste EAE-modeller kræver også en injektion af kighostetoksin for at sygdommen kan udvikle sig. For konsekvent og reproducerbar EAE-induktion er en detaljeret protokol til fremstilling af reagenerne til fremstilling af antigen / adjuvansemulsioner nødvendig. Metoden beskrevet her udnytter en standardiseret metode til at generere vand-i-olie-emulsioner. Det er enkelt og hurtigt og bruger en rystehomogenisator i stedet for sprøjter til fremstilling af kvalitetskontrollerede emulsioner.
Introduction
En nedbrydning af immunologisk tolerance kan resultere i generering af autoimmune lidelser, såsom multipel sklerose (MS). Det anslås, at 2,8 millioner mennesker lever med MS på verdensplan1. Selvom den nøjagtige årsag til MS stadig er stort set ukendt, spiller dysregulering af autoreaktive T- og B-celler samt defekter i Treg-funktionen vigtige roller i patogenesen af sygdommen 2,3.
Dyremodeller af autoimmune sygdomme er vigtige værktøjer til at undersøge potentielle terapeutiske modaliteter. Den eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) model er blevet brugt i næsten et århundrede af forskere interesseret i MS4. I tidlige forsøg var forekomsten af sygdommen relativt lav. Introduktionen af komplet Freunds adjuvans (CFA), der indeholder Mycobacterium og pertussistoksin, muliggjorde konsekvent induktion af EAE hos mus4. Vigtigst er det nødvendigt at blande CFA med et centralnervesystem (CNS) -specifikt antigen for at generere en homogen vand-i-olie-emulsion til inducering af EAE. De mest almindelige aktuelt tilgængelige EAE-modeller er baseret på aktiv immunisering af mus med encephalitogene peptider. Musenes genetiske baggrund spiller en vigtig rolle i sygdomsmodtagelighed, med myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG35-55) og myelin proteolipidprotein (PLP139-151) peptider, der anvendes til at inducere EAE i henholdsvisC57BL / 6J og SJL mus. Imidlertid kan andre musestammer og CNS-afledte peptider også bruges.
Kvaliteten af CFA/peptidemulsionen er en kritisk faktor, der bestemmer sygdomspenetransen i den aktive immunisering EAE model6. En homogen vand-i-olie-emulsion skal fremstilles ved at blande de encephalitogene peptider opløst i vandig buffer med CFA, ellers vil dyr ikke udvikle sygdommen. Der er offentliggjort talrige protokoller om fremstilling af CFA/peptidemulsioner. Eksempler omfatter brugen af en hvirvel7, sonikering8, sprøjter og et trevejs T-stik9 eller en sprøjte kun5. Imidlertid er alle disse metoder vanskelige at standardisere og er ofte forbundet med lange og komplicerede protokoller.
Sammenlignet med alle ovennævnte metoder giver den enkle metode, der er beskrevet her til emulsionspræparat, fordelene ved ikke at have nogen person-til-person-forskelle og være relativt hurtig. Emulsionen genereres af en homogenisator, der ryster reagenserne med en indstillet hastighed, tid og temperatur, hvilket sikrer hurtige og ensartede resultater. Ud over at fremkalde sygdom i EAE-modellen kan denne metode også bruges til at studere andre autoimmune sygdomsmodeller såsom kollageninduceret arthritis (CIA) og antigeninduceret arthritis (AIA)6. Derfor forventes det, at denne metode kan bruges til konsekvent at fremkalde sygdom i andre dyremodeller, der er afhængige af vand-i-olie-emulsioner med autoantigener, såsom eksperimentel autoimmun neuritis (EAN)10, eksperimentel autoimmun thyroiditis (EAT)11, autoimmun uveitis (EAU)12 og myasthenia gravis (MG)13. Denne metode inducerer også generelle immunresponser såsom forsinket overfølsomhed (DTH) konsekvent6 og kan derfor bruges til at levere kræft- og malariavacciner (se diskussion).
Således er der udviklet en hurtig (total forberedelsestid ~ 30 min), enkel (alle reagenser kan fremstilles på forhånd og opbevares) og standardiseret (emulsionen opnås ved hjælp af en rystehomogenisator) metode og præsenteres her. CFA/antigenemulsioner, der er fremstillet ved hjælp af denne protokol, inducerer konsekvent sygdom i autoimmune dyremodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vand-i-olie-emulsioner, såsom antigen / Freunds adjuvans, er blevet brugt i mere end et halvt århundrede til at inducere EAE17. Der er i øjeblikket ingen standardiseret metode til fremstilling af antigenemulsioner, der er uafhængige af menneskelig indflydelse. Manuel blanding ved hjælp af sprøjter er standard for de fleste laboratorier, men denne metode er tidskrævende, resulterer ofte i et for stort tab af materiale, og kvaliteten varierer afhængigt af forskeren, der forbereder den.
<…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatteren vil gerne anerkende dyrestaldene ved Lunds Universitet, Camilla Björklöv og Agnieszka Czopek for deres støtte og Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, UK, for konstruktiv kritik og sproglig støtte til udarbejdelsen af dette manuskript.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells’ Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis–potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
