Eine schnelle, einfache und standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen zur Induktion experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis
Summary
Um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, ein Tiermodell für Multiple Sklerose, zu induzieren, werden Mäuse mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion immunisiert, die ein Autoantigen und ein komplettes Freund-Adjuvans enthält. Während für die Herstellung dieser Emulsionen mehrere Protokolle existieren, wird hier ein schnelles, einfaches und standardisiertes Homogenisierungsprotokoll für die Emulsionsherstellung vorgestellt.
Abstract
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) weist ähnliche immunologische und klinische Merkmale wie Multiple Sklerose (MS) auf und wird daher häufig als Modell verwendet, um neue Wirkstoffziele für eine bessere Patientenbehandlung zu identifizieren. MS ist durch verschiedene Krankheitsverläufe gekennzeichnet: schubförmig-remittierende MS (RRMS), primär progrediente MS (PPMS), sekundär progrediente MS (SPMS) und eine seltene progressiv-schubförmige Form der MS (PRMS). Obwohl Tiermodelle nicht alle diese kontrastierenden Phänotypen menschlicher Krankheiten genau nachahmen, gibt es EAE-Modelle, die einige der verschiedenen klinischen Manifestationen von MS widerspiegeln. Zum Beispiel ahmt Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)-induzierte EAE in C57BL / 6J-Mäusen menschliches PPMS nach, während Myelin-Proteolipidprotein (PLP)-induzierte EAE in SJL / J-Mäusen RRMS ähnelt. Andere Autoantigene, wie Myelin Basic Protein (MBP), und eine Reihe verschiedener Mausstämme werden ebenfalls verwendet, um EAE zu untersuchen. Um eine Erkrankung in diesen Autoantigen-Immunisierungs-EAE-Modellen zu induzieren, wird eine Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt und subkutan injiziert. Die meisten EAE-Modelle erfordern auch eine Injektion von Pertussis-Toxin, damit sich die Krankheit entwickeln kann. Für eine konsistente und reproduzierbare EAE-Induktion ist ein detailliertes Protokoll zur Herstellung der Reagenzien zur Herstellung von Antigen-/Adjuvansemulsionen erforderlich. Das hier beschriebene Verfahren nutzt ein standardisiertes Verfahren zur Erzeugung von Wasser-in-Öl-Emulsionen. Es ist einfach und schnell und verwendet einen Schüttelhomogenisator anstelle von Spritzen, um qualitätskontrollierte Emulsionen herzustellen.
Introduction
Ein Zusammenbruch der immunologischen Toleranz kann zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose (MS) führen. Es wird geschätzt, dass weltweit 2,8 Millionen Menschen mit MS leben1. Obwohl die genaue Ursache der MS noch weitgehend unbekannt ist, spielen Dysregulation autoreaktiver T- und B-Zellen sowie Defekte in der Treg-Funktion eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der Erkrankung 2,3.
Tiermodelle von Autoimmunerkrankungen sind wesentliche Werkzeuge, um mögliche therapeutische Modalitäten zu untersuchen. Das experimentelle Modell der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) wird seit fast einem Jahrhundert von Forschern verwendet, die sich für MS4 interessieren. In frühen Experimenten war die Inzidenz der Krankheit relativ gering. Die Einführung eines vollständigen Freund-Adjuvans (CFA), das Mycobacterium und Pertussis-Toxin enthält, ermöglichte die konsistente Induktion von EAE bei Mäusen4. Am wichtigsten ist, dass CFA mit einem ZNS-spezifischen Antigen gemischt werden muss, um eine homogene Wasser-in-Öl-Emulsion zur Induktion von EAE zu erzeugen. Die derzeit gebräuchlichsten EAE-Modelle basieren auf der aktiven Immunisierung von Mäusen mit enzephalitogenen Peptiden. Der genetische Hintergrund der Mäuse spielt eine wichtige Rolle bei der Krankheitsanfälligkeit, wobei Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG35-55) und Myelin-Proteolipidprotein (PLP139-151) Peptide verwendet werden, um EAE in C57BL / 6J- bzw. SJL-Mäusen zu induzieren5. Es können jedoch auch andere Mausstämme und ZNS-abgeleitete Peptide verwendet werden.
Die Qualität der CFA/Peptid-Emulsion ist ein kritischer Faktor, der die Krankheitspenetranz im aktiven ImmunisierungsmodellEAE 6 bestimmt. Eine homogene Wasser-in-Öl-Emulsion muss hergestellt werden, indem die in wässrigem Puffer gelösten enzephalitogenen Peptide mit CFA gemischt werden, da sonst Tiere die Krankheit nicht entwickeln. Zur Herstellung von CFA/Peptid-Emulsionen wurden zahlreiche Protokolle veröffentlicht. Beispiele umfassen die Verwendung eines Wirbels7, Ultraschall8, Spritzen und eines Drei-Wege-T-Steckers9 oder einer Spritze nur5. Alle diese Methoden sind jedoch schwer zu standardisieren und oft mit langwierigen und komplizierten Protokollen verbunden.
Im Vergleich zu allen oben genannten Methoden bietet die hier beschriebene einfache Methode zur Emulsionsherstellung den Vorteil, dass sie keine Unterschiede von Mensch zu Mensch aufweist und relativ schnell ist. Die Emulsion wird durch einen Homogenisator erzeugt, der die Reagenzien mit einer eingestellten Geschwindigkeit, Zeit und Temperatur schüttelt, um schnelle und konsistente Ergebnisse zu gewährleisten. Neben der Induktion von Krankheiten im EAE-Modell kann diese Methode auch verwendet werden, um andere Autoimmunerkrankungsmodelle wie Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) und Antigen-induzierte Arthritis (AIA) zu untersuchen6. Daher wird erwartet, dass diese Methode verwendet werden kann, um Krankheiten in anderen Tiermodellen konsistent zu induzieren, die auf Wasser-in-Öl-Emulsionen mit Autoantigenen angewiesen sind, wie experimentelle Autoimmunneuritis (EAN)10, experimentelle Autoimmunthyreoiditis (EAT)11, autoimmune Uveitis (EAU)12 und Myasthenia gravis (MG)13. Diese Methode induziert auch allgemeine Immunantworten wie verzögerte Typ-Überempfindlichkeit (DTH) konsistent6 und könnte daher für die Verabreichung von Krebs- und Malariaimpfstoffen verwendet werden (siehe Diskussion).
So wurde eine schnelle (Gesamtherstellungszeit ~30 min), einfache (alle Reagenzien können im Voraus hergestellt und gelagert werden) und standardisierte (die Emulsion wird mit einem Schüttelhomogenisator erreicht) Methode entwickelt und hier vorgestellt. Die nach diesem Protokoll hergestellten CFA/Antigen-Emulsionen induzieren in Autoimmuntiermodellen durchweg Krankheiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie das Antigen/Freund-Adjuvans, werden seit mehr als einem halben Jahrhundert verwendet, um EAE17 zu induzieren. Derzeit gibt es keine standardisierte Methode zur Herstellung von Antigenemulsionen, die unabhängig vom menschlichen Einfluss ist. Das manuelle Mischen mit Spritzen ist in den meisten Laboratorien Standard, jedoch ist diese Methode zeitaufwendig, führt oft zu einem übermäßigen Materialverlust und die Qualität unterscheidet sich je nach Wissenschaftler, d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor dankt den Tierhaltungseinheiten der Universität Lund, Camilla Björklöv und Agnieszka Czopek, für ihre Unterstützung und Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, UK, für konstruktive Kritik und linguistische Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells’ Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis–potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
