प्रायोगिक ऑटोम्यून्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस को प्रेरित करने के लिए एंटीजन / सहायक इमल्शन तैयार करने के लिए एक तीव्र, सरल और मानकीकृत होमोजेनाइजेशन विधि
Summary
प्रयोगात्मक ऑटोम्यून्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस को प्रेरित करने के लिए, मल्टीपल स्केलेरोसिस का एक पशु मॉडल, चूहों को एक ऑटोएंटीजन युक्त पानी-इन-ऑयल इमल्शन के साथ प्रतिरक्षित किया जाता है और फ्रायंड के सहायक को पूरा करता है। जबकि इन इमल्शन की तैयारी के लिए कई प्रोटोकॉल मौजूद हैं, इमल्शन तैयारी के लिए एक तेज़, सरल और मानकीकृत होमोजेनाइजेशन प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है।
Abstract
प्रायोगिक ऑटोम्यून्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) के साथ समान प्रतिरक्षात्मक और नैदानिक विशेषताओं को साझा करता है, और इसलिए बेहतर रोगी उपचार के लिए नए दवा लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एक मॉडल के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। एमएस को कई अलग-अलग रोग पाठ्यक्रमों की विशेषता है: रिलैप्सिंग-रेमिटिंग एमएस (आरआरएमएस), प्राथमिक प्रगतिशील एमएस (पीपीएमएस), माध्यमिक प्रगतिशील एमएस (एसपीएमएस), और एमएस (पीआरएमएस) का एक दुर्लभ प्रगतिशील-रिलैप्सिंग रूप। यद्यपि पशु मॉडल इन सभी विपरीत मानव रोग फेनोटाइप्स की सटीक नकल नहीं करते हैं, लेकिन ईएई मॉडल हैं जो एमएस के कुछ विभिन्न नैदानिक अभिव्यक्तियों को दर्शाते हैं। उदाहरण के लिए, सी 57बीएल / 6 जे चूहों में माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) -प्रेरित ईएई मानव पीपीएमएस की नकल करता है, जबकि एसजेएल / जे चूहों में माइलिन प्रोटियोलिपिड प्रोटीन (पीएलपी) -प्रेरित ईएई आरआरएमएस जैसा दिखता है। अन्य ऑटोएंटीजन, जैसे माइलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी), और कई अलग-अलग माउस उपभेदों का उपयोग ईएई का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। इन ऑटोएंटीजन-टीकाकरण ईएई मॉडल में बीमारी को प्रेरित करने के लिए, एक पानी-इन-ऑयल इमल्शन तैयार किया जाता है और चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया जाता है। अधिकांश ईएई मॉडल को बीमारी विकसित करने के लिए पर्टुसिस विष के इंजेक्शन की भी आवश्यकता होती है। सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ईएई प्रेरण के लिए, अभिकर्मकों को एंटीजन / सहायक इमल्शन का उत्पादन करने के लिए तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल आवश्यक है। यहां वर्णित विधि पानी-इन-ऑयल इमल्शन उत्पन्न करने के लिए एक मानकीकृत विधि का लाभ उठाती है। यह सरल और तेज़ है और गुणवत्ता-नियंत्रित इमल्शन तैयार करने के लिए सिरिंज के बजाय एक हिलाने वाले होमोजेनाइज़र का उपयोग करता है।
Introduction
इम्यूनोलॉजिकल सहिष्णुता के टूटने से ऑटोइम्यून विकारों की पीढ़ी हो सकती है, जैसे कि मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस)। यह अनुमान लगाया गया हैकि दुनिया भर में 2.8 मिलियन लोग एमएस के साथ रह रहे हैं। यद्यपि एमएस का सटीक कारण अभी भी काफी हद तक अज्ञात है, ऑटोरिएक्टिव टी और बी कोशिकाओं की विकृति, साथ ही ट्रेग फ़ंक्शन में दोष, रोगके रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं 2,3.
ऑटोइम्यून रोगों के पशु मॉडल संभावित चिकित्सीय तौर-तरीकों की जांच के लिए आवश्यक उपकरण हैं। प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मॉडल का उपयोग एमएस4 में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं द्वारा लगभग एक सदी के लिए किया गया है। शुरुआती प्रयोगों में, बीमारी की घटना अपेक्षाकृत कम थी। माइकोबैक्टीरियम और पर्टुसिस टॉक्सिन युक्त पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) की शुरूआत ने चूहों में ईएई के लगातार प्रेरण को सक्षमकिया। सबसे महत्वपूर्ण बात, ईएई को प्रेरित करने के लिए एक समरूप पानी-इन-ऑयल इमल्शन उत्पन्न करने के लिए सीएफए को एक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) -विशिष्ट एंटीजन के साथ मिलाना आवश्यक है। वर्तमान में उपलब्ध सबसे आम ईएई मॉडल एन्सेफेलिटोजेनिक पेप्टाइड्स के साथ चूहों के सक्रिय टीकाकरण पर आधारित हैं। चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि रोग संवेदनशीलता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जिसमें माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी35-55) और माइलिन प्रोटिओलिपिड प्रोटीन (पीएलपी139-151) पेप्टाइड्स का उपयोग क्रमशः सी 57बीएल / 6 जे और एसजेएल चूहों में ईएई को प्रेरित करने के लिए कियाजाता है। हालांकि, अन्य माउस उपभेदों और सीएनएस-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स का भी उपयोग किया जा सकता है।
पेप्टाइड इमल्शन की गुणवत्ता एक महत्वपूर्ण कारक है जो सक्रिय टीकाकरण ईएई मॉडल 6 में रोग पेनेट्रेंस निर्धारित करताहै। सीएफए के साथ जलीय बफर में घुले एन्सेफेलिटोजेनिक पेप्टाइड्स को मिलाकर एक सजातीय पानी-इन-ऑयल इमल्शन तैयार किया जाना चाहिए, अन्यथा जानवरों में बीमारी विकसित नहीं होगी। पेप्टाइड इमल्शन की तैयारी पर कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं। उदाहरणों में एक भंवर7, सोनिकेशन8, सिरिंज और तीन-तरफा टी कनेक्टर9, या एक सिरिंज केवल5 का उपयोग शामिल है। हालांकि, इन सभी विधियों को मानकीकृत करना मुश्किल है और अक्सर लंबे और जटिल प्रोटोकॉल से जुड़े होते हैं।
उपरोक्त सभी विधियों की तुलना में, इमल्शन तैयारी के लिए यहां वर्णित सरल विधि कोई व्यक्ति-से-व्यक्ति अंतर नहीं होने और अपेक्षाकृत तेज होने के फायदे प्रदान करती है। इमल्शन एक होमोजेनाइज़र द्वारा उत्पन्न होता है जो अभिकर्मकों को एक निर्धारित गति, समय और तापमान के साथ हिलाता है, जिससे तेज और सुसंगत परिणाम सुनिश्चित होते हैं। ईएई मॉडल में रोग को प्रेरित करने के अलावा, इस विधि का उपयोग कोलेजन-प्रेरित गठिया (सीआईए) और एंटीजन प्रेरित गठिया (एआईए) 6 जैसे अन्य ऑटोइम्यून रोग मॉडल का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। इसलिए, यह अनुमान लगाया गया है कि इस विधि का उपयोग अन्य पशु मॉडल में बीमारी को लगातार प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है जो ऑटोएंटीजन के साथ पानी-इन-ऑयल इमल्शन पर निर्भर करते हैं, जैसे कि प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून न्यूरिटिस (ईएएन)10, प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस (ईएटी)11, ऑटोइम्यून यूवाइटिस (ईएयू)12, और मायस्थेनिया ग्रेविस (एमजी)13। यह विधि सामान्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को भी प्रेरित करती है जैसे कि विलंबित-प्रकार अतिसंवेदनशीलता (डीटीएच) लगातार6, और इसलिए इसका उपयोग कैंसर और मलेरिया के टीके देने के लिए किया जा सकता है (चर्चा देखें)।
इस प्रकार, एक तेजी से (कुल तैयारी समय ~ 30 मिनट), सरल (सभी अभिकर्मकों को पहले से तैयार और संग्रहीत किया जा सकता है), और मानकीकृत (इमल्शन को एक हिलाने वाले होमोजेनाइज़र का उपयोग करके पूरा किया जाता है) विधि विकसित की गई है और यहां प्रस्तुत की गई है। एंटीजन इमल्शन इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए ऑटोइम्यून पशु मॉडल में लगातार बीमारी को प्रेरित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
पानी में तेल इमल्शन, जैसे एंटीजन / फ्रायंड के सहायक, ईएई17 को प्रेरित करने के लिए आधी सदी से अधिक समय से उपयोग किया गया है। वर्तमान में एंटीजन इमल्शन तैयार करने के लिए कोई मानकीकृत विधि नहीं है जो ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक लुंड विश्वविद्यालय में पशु आवास इकाइयों, कैमिला ब्योर्कलोव और एग्निएस्का क्ज़ोपेक को उनके समर्थन के लिए और रिचर्ड विलियम्स, कैनेडी इंस्टीट्यूट ऑफ रुमेटोलॉजी, ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय, यूके में रचनात्मक आलोचना और इस पांडुलिपि के निर्माण के लिए भाषाई समर्थन के लिए स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
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