ミトコンドリアとリソソームの蛍光色素によるマイトファジーの可視化
Summary
マイトファジーは、ミトコンドリアの品質管理の主要なメカニズムです。しかしながら、 in vivoでの マイトファジーの評価は、信頼できる定量アッセイの欠如によって妨げられている。ここでは、細胞透過性の緑色蛍光ミトコンドリア色素と赤色蛍光リソソーム色素を使用して、生細胞内のマイトファジーを観察するためのプロトコルを紹介します。
Abstract
細胞の原動力であるミトコンドリアは、生体エネルギー学、フリーラジカル生成、カルシウム恒常性、およびアポトーシスにおいて重要な役割を果たしています。マイトファジーはミトコンドリアの品質管理の主要なメカニズムであり、一般的に顕微鏡観察を使用して研究されていますが、 in vivo マイトファジーアッセイは実行が困難です。生きた細胞小器官をイメージングしてマイトファジーを評価することは、ミトコンドリア研究のための代替的かつ必要な方法です。このプロトコルでは、細胞透過性緑色蛍光ミトコンドリア色素MitoTracker Greenおよび赤色蛍光リソソーム色素LysoTracker Redを生細胞で使用するための手順を、色素の負荷、ミトコンドリアおよびリソソームの可視化、および期待される結果を含めて説明します。生細胞中のマイトファジーを評価するための詳細な手順、および顕微鏡ソフトウェアの設定に関するテクニカルノートも提供されています。この方法は、研究者が生細胞蛍光顕微鏡を使用してマイトファジーを観察するのに役立ちます。さらに、ミトコンドリアとリソソームの定量化やミトコンドリアの形態の評価にも使用できます。
Introduction
ミトコンドリアは、ほぼすべての真核細胞の原動力です1,2。酸化的リン酸化によるATP産生に加えて、ミトコンドリアは、生体エネルギー、カルシウム恒常性、フリーラジカル生成、アポトーシス、細胞恒常性などの他のプロセスにおいて重要な役割を果たします3,4,5。ミトコンドリアは電子伝達系内の複数の複合体から活性酸素種(ROS)を生成するため、潜在的な酸化ストレスによって絶えず刺激され、抗酸化防御システムが崩壊すると、最終的には構造的損傷や機能不全につながる可能性があります6,7。ミトコンドリア機能障害は、代謝障害、神経変性、心血管疾患など、多くの疾患に寄与することがわかっています8。したがって、健康なミトコンドリア集団とその適切な機能を維持することが重要です。ミトコンドリアは非常に可塑的で動的な細胞小器官です。それらの形態と機能は、ミトコンドリアタンパク質の翻訳後修飾(PTM)、ミトコンドリア生合成、融合、分裂、およびマイトファジーを含むミトコンドリア品質管理メカニズムによって制御されています9,10。ダイナミンスーパーファミリーのタンパク質のGTPアーゼであるダイナミン関連タンパク質1(DRP1)によって媒介されるミトコンドリア分裂は、小さくて丸いミトコンドリアをもたらし、機能不全のミトコンドリアを分離し、マイトファジーによって除去および分解することができます11,12。
マイトファジーは、オートファジーによってミトコンドリアを選択的に分解する細胞プロセスであり、通常、損傷、老化、またはストレスの後に損傷したミトコンドリアで発生します。続いて、これらのミトコンドリアは、分解のためにリソソームに送達される10。したがって、マイトファジーは、広範囲の細胞型においてミトコンドリアの量と質を健康な状態に維持するのに役立つ異化プロセスです。これは、通常の生理学的およびストレス条件下での細胞の恒常性の回復に重要な役割を果たします13,14。細胞は、細胞ストレスおよび発生変化の異なるシグナルによって誘発される複雑なマイトファジー機構によって特徴付けられる。マイトファジー調節経路は、ユビキチン依存性または受容体依存性に分類されます15,16;ユビキチン依存性オートファジーは、キナーゼPINK1とユビキチンリガーゼParkin E3のミトコンドリアへの動員によって媒介されますが17,18、受容体依存性オートファジーは、ミトコンドリア損傷に応答してマイトファジーを媒介する微小管関連タンパク質軽鎖LC3へのオートファジー受容体の結合を含みます19。
透過型電子顕微鏡(TEM)は、マイトファジーを観察および検出するために最も一般的に使用される方法であり、依然として最良の方法の1つです20。マイトファジーの形態学的特徴は、オートファゴソームまたはオートファゴソームとリソソームの融合によって形成されるオートリソソームであり、これは電子顕微鏡画像から観察することができる21。しかし、電子顕微鏡(EM)の弱点は、生細胞20におけるミトコンドリア脱分極、ミトコンドリア分裂、オートファゴソームとリソソームの融合などのマイトファジーの動的プロセスを監視できないことです。したがって、生体オルガネラのイメージングを通じてマイトファジーを評価することは、ミトコンドリア研究の魅力的な代替方法です。ここで説明するライブセルイメージング技術は、2つの蛍光色素を使用してミトコンドリアとリソソームを染色します。マイトファジーが発生すると、オートファゴソームに取り込まれた損傷または余分なミトコンドリアはミトコンドリア色素によって緑色に染色され、赤色染料はリソソームを染色します。オートリソソームと呼ばれるこれらのオートファゴソームとリソソームの融合により、緑と赤の蛍光が重なり合って黄色の点として現れ、マイトファジーの発生を示します22。細胞透過性ミトコンドリア色素(MitoTracker Green)には、ミトコンドリア23を標識するための軽度のチオール反応性クロロメチル部分が含まれています。ミトコンドリアを標識するために、細胞は単に色素と共にインキュベートされ、それは原形質膜を横切って受動的に拡散しそして活性ミトコンドリアに蓄積する。このミトコンドリア色素は生細胞を容易に染色することができ、アルデヒド固定または死細胞の染色にはあまり効果的ではありません。リソソーム色素(LysoTracker Red)は、生細胞の酸性細胞小器官の標識と追跡に使用される蛍光アシドトロピックプローブです。この色素は酸性細胞小器官に対して高い選択性を示し、ナノモル濃度で生細胞を効果的に標識することができます24。
ここでは、これらの蛍光色素を生細胞に使用する手順(色素のロード、ミトコンドリアとリソソームの可視化など)について説明します。この方法は、研究者が生細胞蛍光顕微鏡を使用してマイトファジーを観察するのに役立ちます。また、ミトコンドリアとリソソームの定量化、およびミトコンドリアの形態の評価にも使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、オートファゴソーム、リソソーム、およびミトコンドリア分裂を含む生細胞におけるマイトファジーの動的プロセスを、細胞透過性ミトコンドリアおよびリソソーム色素との共染色を通じて評価およびモニタリングする方法を提供します。この方法は、ミトコンドリアを同定し、ミトコンドリアの形態を評価するためにも使用できます。この研究で使用される?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の一部は、中国国家重点研究開発プログラム(2017YFA0105601、2018YFA0107102)、中国国家自然科学基金会(81970333,31901044)、および上海高等教育機関の特別任命教授プログラム(GZ2020008)によって資金提供されました。
Materials
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
References
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