تصوير الفاصل الزمني 3-D لديناميات جدار الخلية باستخدام Calcofluor في الطحالب Physcomitrium patens
Summary
تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتصوير ديناميكيات جدار الخلية 3-D لأنسجة الطحالب الحية ، مما يسمح بتصور انفصال جدران الخلايا في طفرات ggb وأنماط جدار الخلية السميكة في النوع البري أثناء التطور على مدى فترة طويلة.
Abstract
يسمح التصوير بفاصل زمني باستخدام الفحص المجهري الفلوري بمراقبة التغيرات الديناميكية للنمو والتطور على المستويين الخلوي ودون الخلوي. بشكل عام ، بالنسبة للملاحظات على مدى فترة طويلة ، تتطلب التقنية تحويل بروتين الفلورسنت. ومع ذلك ، بالنسبة لمعظم الأنظمة ، يكون التحول الجيني إما مستهلكا للوقت أو غير متاح تقنيا. تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا للتصوير ثلاثي الأبعاد بفاصل زمني لديناميكيات جدار الخلية على مدار 3 أيام باستخدام صبغة كالكوفلور (التي تلطخ السليلوز في جدار الخلية النباتية) ، والتي تم تطويرها في الطحالب Physcomitrium patens. إشارة صبغة calcofluor من جدار الخلية مستقرة ويمكن أن تستمر لمدة 1 أسبوع دون تسوس واضح. باستخدام هذه الطريقة ، فقد ثبت أن انفصال الخلايا في طفرات ggb (حيث يتم التخلص من الوحدة الفرعية بيتا للبروتين geranylgeranyltransferase-I) ناتج عن توسع الخلية غير المنظم وعيوب سلامة جدار الخلية. علاوة على ذلك ، تتغير أنماط تلطيخ الكلكوفلور بمرور الوقت. ترتبط المناطق الأقل تلطيخا بشكل مكثف بمواقع توسع / تفرع الخلايا المستقبلية في النوع البري. يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الأنظمة الأخرى التي تحتوي على جدران خلوية والتي يمكن تلطيخها بواسطة الكلكوفلور.
Introduction
تخضع جدران الخلايا النباتية لتغيرات ديناميكية أثناء تمدد الخلايا وتطورها1،2،3. يعد الحفاظ على سلامة جدار الخلية أمرا بالغ الأهمية للالتصاق الخلايا النباتية أثناء النمو والتطور ، وكذلك للاستجابة للإشارات البيئية. على الرغم من أن تصور ديناميكيات جدار الخلية للخلايا الحية على مدى فترة طويلة من الزمن أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية الحفاظ على التصاق الخلايا أثناء التطور والتكيف مع التغيرات البيئية ، إلا أن الطرق الحالية لمراقبة ديناميكيات جدار الخلية مباشرة لا تزال صعبة.
يمكن أن يوفر التصوير بفاصل زمني للتغيرات الخلوية ديناميكيات تنموية مفيدة للكائن الحي باستخدام مجهر مضان عالي الدقة4،5،6،7. في حين أن التصوير ثلاثي الأبعاد بفاصل زمني لديه قدر كبير من الإمكانات لدراسة التغيرات الديناميكية لشكل الخلية أثناء النمو والتطور ، فإن التقنية تتطلب عادة تحويل بروتين الفلورسنت4،5،6،7. ومع ذلك ، بالنسبة لمعظم الأنظمة ، فإن التحولات الجينية إما تستغرق وقتا طويلا أو تمثل تحديا تقنيا. كبديل ، كانت الأصباغ الفلورية التي ترتبط بالمكونات الخلوية متاحة منذ فترة طويلة. يمكن أن تنبعث الأصباغ الفلورية من ضوء الفلورسنت بعد التشعيع بضوء بطول موجي معين. الأمثلة الشائعة هي Edu و DAPI و PI و FM4-64 و calcofluor white8،9،10. ومع ذلك ، فإن أحد العيوب الرئيسية هو أن هذه الأصباغ لا يمكن استخدامها عادة إلا في الأنسجة الثابتة أو للتجارب القصيرة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الضرر الذي تسببه للخلية8،9،10.
مع البروتوكول المقدم هنا ، تكون إشارات calcofluor مستقرة عندما يتم خلط كالكوفلور الأبيض داخل الوسط أثناء تجارب الفاصل الزمني في الطحالب P. patens. باستخدام هذه الطريقة ، لوحظ انفصال الخلايا في طفرات ggb باستخدام التصوير بفاصل زمني ثلاثي الأبعاد على مدى فترة 3 أيام3 (الشكل 1). يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الأنظمة الأخرى التي تحتوي على جدران خلوية والتي يمكن تلطيخها بواسطة الكلكوفلور.
Protocol
Representative Results
Discussion
إعادة بناء 3-D بفاصل زمني ، أو تصوير 4-D ، هي أداة قوية لمراقبة ديناميات التشكل الخلوي أثناء العمليات التنموية. في هذا البروتوكول ، عن طريق خلط الكلس الأبيض في الوسط ، يمكن ملاحظة ديناميات التشكل الخلوي 3-D في الطحلب P. patens. باستخدام هذه الطريقة ، لاحظنا أن سطح جدران الخلايا في طفرات ggb …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتورة سوسي باتريشيا وبيتي نان من جامعة لويزفيل للمساعدة في المجهر متحد البؤر. تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (1456884 إلى MPR) ومن خلال اتفاقية تعاونية لمؤسسة العلوم الوطنية (1849213 إلى MPR).
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
