3-D Time-Lapse Imaging af cellevægsdynamik ved hjælp af Calcofluor i Moss Physcomitrium patens
Summary
Dette manuskript præsenterer en detaljeret protokol til at afbilde 3D-cellevægsdynamikken i levende mosvæv, hvilket muliggør visualisering af frigørelse af cellevægge i ggb-mutanter og fortykkelse af cellevægsmønstre i vildtypen under udvikling over en lang periode.
Abstract
Time-lapse billeddannelse med fluorescensmikroskopi tillader observation af de dynamiske ændringer i vækst og udvikling på cellulære og subcellulære niveauer. Generelt kræver teknikken til observationer over en lang periode transformation af et fluorescerende protein; Men for de fleste systemer er genetisk transformation enten tidskrævende eller teknisk utilgængelig. Dette manuskript præsenterer en protokol for 3-D time-lapse billeddannelse af cellevægsdynamik over en 3-dages periode ved hjælp af calcofluorfarvestof (som pletter cellulose i plantecellevæggen), udviklet i mos Physcomitrium patens. Calcofluorfarvestofsignalet fra cellevæggen er stabilt og kan vare i 1 uge uden åbenlyst henfald. Ved hjælp af denne metode har det vist sig, at frigørelsen af celler i ggb-mutanter (hvor proteinet geranylgeranyltransferase-I beta-underenhed er slået ud) skyldes ureguleret celleudvidelse og cellevægintegritetsdefekter. Desuden ændres mønstrene for calcofluorfarvning over tid; Mindre intenst farvede områder korrelerer med de fremtidige celleudvidelses- / forgreningssteder i vildtypen. Denne metode kan anvendes på mange andre systemer, der indeholder cellevægge, og som kan farves af calcofluor.
Introduction
Plantecellevægge gennemgår dynamiske ændringer under celleudvidelse og udvikling 1,2,3. Opretholdelse af cellevægsintegritet er afgørende for plantecelleadhæsion under vækst og udvikling samt for reaktionen på miljøsignaler. Selvom visualisering af cellevægsdynamik i levende celler over en lang periode er afgørende for at forstå, hvordan celleadhæsion opretholdes under udvikling og tilpasning til miljøændringer, er de nuværende metoder til direkte observation af cellevægsdynamik stadig udfordrende.
Time-lapse billeddannelse af cellulære ændringer kan give informativ udviklingsdynamik af en organisme ved hjælp af et fluorescensmikroskop med høj opløsning 4,5,6,7. Mens time-lapse 3D-billeddannelse har et stort potentiale for at studere dynamiske ændringer af celleform under vækst og udvikling, kræver teknikken normalt transformation af et fluorescerende protein 4,5,6,7. Men for de fleste systemer er genetiske transformationer enten tidskrævende eller teknisk udfordrende. Som et alternativ har fluorescerende farvestoffer, der fastgøres til cellulære komponenter, længe været tilgængelige. De fluorescerende farvestoffer kan udsende fluorescerende lys efter bestråling med lys med en bestemt bølgelængde. Almindelige eksempler er Edu, DAPI, PI, FM4-64 og calcofluor hvid 8,9,10. En stor ulempe er imidlertid, at disse farvestoffer typisk kun kan bruges i fast væv eller til korte forsøg, delvis på grund af den skade, de forårsager på cellen 8,9,10.
Med protokollen præsenteret her er calcofluorsignaler stabile, når calcofluor hvid blandes i mediet under time-lapse-eksperimenter i mos P. patens. Ved hjælp af denne metode blev frigørelsen af celler i ggb-mutanter ved hjælp af 3-D time-lapse-billeddannelse observeret over en 3-dages periode3 (figur 1). Denne metode kan anvendes på mange andre systemer, der indeholder cellevægge, og som kan farves af calcofluor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse 3-D rekonstruktion, eller 4-D billeddannelse, er et kraftfuldt værktøj til at observere dynamikken i cellulær morfologi under udviklingsprocesser. I denne protokol kan dynamikken i 3D-cellulær morfologi observeres i mosen P. patens ved at blande calcofluorhviden i mediet. Ved hjælp af denne metode observerede vi, at overfladen af cellevægge i ggb-mutanter rives fra hinanden under udvikling3. Desuden er den reducerede fortykkelse af cellevægge korreleret med cell…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Soucy Patricia og Betty Nunn ved University of Louisville for hjælp med det konfokale mikroskop. Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation (1456884 til MPR) og af en National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 til MPR).
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
