मॉस फिकोमिट्रियम पेटेंस में कैल्कोफ्लोर का उपयोग करके सेल वॉल डायनामिक्स की 3-डी टाइम-लैप्स इमेजिंग
Summary
यह पांडुलिपि जीवित काई ऊतक की 3-डी सेल दीवार गतिशीलता को चित्रित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है, जिससे जीजीबी उत्परिवर्ती में सेल की दीवारों की टुकड़ी के दृश्य और लंबे समय तक विकास के दौरान जंगली प्रकार में सेल की दीवार पैटर्न को मोटा करने की अनुमति मिलती है।
Abstract
फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ टाइम-लैप्स इमेजिंग सेलुलर और उपकोशिकीय स्तरों पर विकास और विकास के गतिशील परिवर्तनों के अवलोकन की अनुमति देता है। सामान्य तौर पर, लंबी अवधि में टिप्पणियों के लिए, तकनीक को फ्लोरोसेंट प्रोटीन के परिवर्तन की आवश्यकता होती है; हालांकि, अधिकांश प्रणालियों के लिए, आनुवंशिक परिवर्तन या तो समय लेने वाला या तकनीकी रूप से अनुपलब्ध है। यह पांडुलिपि कैल्कोफ्लोर डाई (जो प्लांट सेल की दीवार में सेल्यूलोज को दाग देती है) का उपयोग करके 3 दिन की अवधि में सेल दीवार गतिशीलता की 3-डी टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है, जिसे मॉस फिकोमिट्रियम पेटेंस में विकसित किया गया है। सेल की दीवार से कैल्कोफ्लोर डाई सिग्नल स्थिर है और स्पष्ट क्षय के बिना 1 सप्ताह तक रह सकता है। इस विधि का उपयोग करके, यह दिखाया गया है कि जीजीबी उत्परिवर्ती में कोशिकाओं की टुकड़ी (जिसमें प्रोटीन गेरानिलजेरनिलट्रांसफेरेज़-आई बीटा सबयूनिट को बाहर कर दिया जाता है) अनियमित सेल विस्तार और सेल दीवार अखंडता दोषों के कारण होता है। इसके अलावा, समय के साथ कैल्कोफ्लोर धुंधला होने के पैटर्न बदलते हैं; कम तीव्रता से दाग वाले क्षेत्र जंगली प्रकार में भविष्य के सेल विस्तार / शाखाओं के स्थलों के साथ सहसंबंधित हैं। इस विधि को कई अन्य प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है जिनमें सेल की दीवारें होती हैं और जिन्हें कैल्कोफ्लोर द्वारा दाग दिया जा सकता है।
Introduction
प्लांट सेल की दीवारें सेल विस्तार और विकास 1,2,3 के दौरान गतिशील परिवर्तनों से गुजरती हैं। सेल दीवार अखंडता को बनाए रखना विकास और विकास के दौरान पौधे सेल आसंजन के साथ-साथ पर्यावरणीय संकेतों की प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। यद्यपि लंबे समय तक जीवित कोशिकाओं की सेल दीवार गतिशीलता की कल्पना करना यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि पर्यावरणीय परिवर्तनों के विकास और अनुकूलन के दौरान सेल आसंजन कैसे बनाए रखा जाता है, सेल दीवार गतिशीलता को सीधे देखने के लिए वर्तमान तरीके अभी भी चुनौतीपूर्ण हैं।
सेलुलर परिवर्तनों की टाइम-लैप्स इमेजिंग एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप 4,5,6,7 का उपयोग करके एक जीव की सूचनात्मक विकास गतिशीलता प्रदान कर सकती है। जबकि टाइम-लैप्स 3-डी इमेजिंग में विकास और विकास के दौरान सेल आकार के गतिशील परिवर्तनों का अध्ययन करने की बहुत क्षमता है, तकनीक को आमतौर पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन 4,5,6,7 के परिवर्तन की आवश्यकता होती है। हालांकि, अधिकांश प्रणालियों के लिए, आनुवंशिक परिवर्तन या तो समय लेने वाले या तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण होते हैं। एक विकल्प के रूप में, फ्लोरोसेंट रंजक जो सेलुलर घटकों से जुड़ते हैं, लंबे समय से उपलब्ध हैं। फ्लोरोसेंट रंजक एक निश्चित तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के साथ विकिरण के बाद फ्लोरोसेंट प्रकाश का उत्सर्जन कर सकते हैं। सामान्य उदाहरण एडु, डीएपीआई, पीआई, एफएम 4-64 और कैल्कोफ्लोर व्हाइट 8,9,10 हैं। हालांकि, एक बड़ी खामी यह है कि इन रंगों का उपयोग आमतौर पर केवल निश्चित ऊतक में या छोटे प्रयोगों के लिए किया जा सकता है, आंशिक रूप से सेल 8,9,10 को होने वाले नुकसान के कारण।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ, कैल्कोफ्लोर सिग्नल स्थिर होते हैं जब काई पी पेटेंस में टाइम-लैप्स प्रयोगों के दौरान माध्यम के भीतर कैल्कोफ्लोर सफेद मिलाया जाता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, 3-डी टाइम-लैप्स इमेजिंग का उपयोग करके जीजीबी उत्परिवर्ती में कोशिकाओं की टुकड़ी 3 दिन की अवधि3 (चित्रा 1) में देखी गई थी। इस विधि को कई अन्य प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है जिनमें सेल की दीवारें होती हैं और जिन्हें कैल्कोफ्लोर द्वारा दाग दिया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
टाइम-लैप्स 3-डी पुनर्निर्माण, या 4-डी इमेजिंग, विकास प्रक्रियाओं के दौरान सेलुलर आकृति विज्ञान की गतिशीलता को देखने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इस प्रोटोकॉल में, माध्यम में कैल्कोफ्लोर सफेद को मिलाकर,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने कंफोकल माइक्रोस्कोप के साथ सहायता के लिए लुइसविले विश्वविद्यालय में डॉ सूसी पेट्रीसिया और बेट्टी नन को धन्यवाद दिया। इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (1456884 से एमपीआर) और एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन सहकारी समझौते (1849213 से एमपीआर) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
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