コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング
Summary
本論文は、生きたコケ組織の3次元細胞壁動態を画像化するための詳細なプロトコルを提示し、長期間にわたる発生中の野生型における ggb 変異体の細胞壁の剥離と肥厚する細胞壁パターンの可視化を可能にします。
Abstract
蛍光顕微鏡によるタイムラプスイメージングにより、細胞および細胞内レベルでの成長と発達の動的な変化を観察できます。一般に、長期間にわたる観察のために、この技術は蛍光タンパク質の形質転換を必要とする。ただし、ほとんどのシステムでは、遺伝子形質転換には時間がかかるか、技術的に利用できません。この原稿は、コケの Physcomitrium patensで開発されたカルコフルオロ色素(植物細胞壁のセルロースを染色する)を使用して、3日間にわたる細胞壁ダイナミクスの3Dタイムラプスイメージングのプロトコルを提示します。細胞壁からのカルコフルオール色素シグナルは安定しており、明らかな崩壊なしに1週間持続します。この方法を使用して、 ggb 変異体(タンパク質ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ-Iベータサブユニットがノックアウトされている)における細胞の剥離は、調節されていない細胞増殖および細胞壁完全性の欠陥によって引き起こされることが示されている。さらに、カルコフルアー染色のパターンは時間とともに変化します。それほど強く染色されていない領域は、野生型の将来の細胞増殖/分岐部位と相関しています。この方法は、細胞壁を含み、calcofluorによって染色することができる他の多くのシステムに適用することができます。
Introduction
植物細胞壁は、細胞の拡大と発生の間に動的な変化を受けます1,2,3。細胞壁の完全性を維持することは、成長および発生中の植物細胞の接着、および環境シグナルへの応答にとって重要です。発生中の細胞接着や環境変化への適応を理解するためには、生細胞の細胞壁動態を長期間可視化することが重要ですが、細胞壁動態を直接観察する方法は依然として課題です。
細胞変化のタイムラプスイメージングは、高解像度蛍光顕微鏡4,5,6,7を用いて生物の有益な発生動態を提供することができる。タイムラプス3Dイメージングは、成長および発生中の細胞形状の動的変化を研究するための大きな可能性を秘めていますが、この技術は通常、蛍光タンパク質の形質転換を必要とします4,5,6,7。ただし、ほとんどのシステムでは、遺伝子変換には時間がかかるか、技術的に困難です。代替として、細胞成分に付着する蛍光色素が長い間利用可能であった。蛍光色素は、特定の波長の光を照射した後に蛍光を発することができる。一般的な例は、Edu、DAPI、PI、FM4-64、およびカルコフルーアホワイト8,9,10です。しかしながら、1つの大きな欠点は、これらの色素が細胞に害を及ぼすこともあり、通常、固定組織または短時間の実験にしか使用できないことである8、9、10。
ここに示すプロトコルでは、コケP.パテンのタイムラプス実験中にカルコフルーアホワイトが培地内に混合されると、カルコフルーア信号は安定しています。この方法を用いて、3Dタイムラプスイメージングを用いてggb変異体における細胞の剥離を3日間にわたって観察した(図1)。この方法は、細胞壁を含み、calcofluorによって染色することができる他の多くのシステムに適用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
タイムラプス3D再構成、または4Dイメージングは、発生過程における細胞形態のダイナミクスを観察するための強力なツールです。このプロトコールでは、カルコフルオールホワイトを培地に混合することにより、コケ P.パテンの3D細胞形態の動態を観察することができます。この方法を用いて、 ggb 変異体の細胞壁の表面が発生中に引き裂かれることを観察しまし?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、共焦点顕微鏡の支援について、ルイビル大学のSoucy Patricia博士とBetty Nunn博士に感謝の意を表している。この研究は、全米科学財団(1456884からMPR)および全米科学財団協力協定(1849213からMPR)によって資金提供されました。
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
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