이끼 피스코미트리움 파텐스에서 칼코플루오르를 사용한 세포벽 역학의 3D 타임랩스 이미징
Summary
이 원고는 살아있는 이끼 조직의 3D 세포벽 역학을 이미지화하는 상세한 프로토콜을 제시하여 장기간에 걸쳐 발달하는 동안 ggb 돌연변이에서 세포벽의 분리와 야생형의 세포벽 패턴을 두껍게 시각화할 수 있습니다.
Abstract
형광 현미경을 사용한 타임랩스 이미징을 통해 세포 및 세포하 수준에서 성장 및 발달의 동적 변화를 관찰할 수 있습니다. 일반적으로 장기간에 걸친 관찰을 위해이 기술은 형광 단백질의 변형이 필요합니다. 그러나 대부분의 시스템에서 유전자 변형은 시간이 많이 걸리거나 기술적으로 사용할 수 없습니다. 이 원고는 이끼 Physcomitrium patens에서 개발 된 calcofluor 염료 (식물 세포벽의 셀룰로오스를 염색)를 사용하여 3 일 동안 세포벽 역학의 3D 타임 랩스 이미징을위한 프로토콜을 제시합니다. 세포벽의 칼코플루오르 염료 신호는 안정적이며 명백한 감쇠 없이 1주일 동안 지속될 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 ggb 돌연변이 체 (단백질 제라 닐 제라 닐 트랜스퍼 라제 -I 베타 서브 유닛이 녹아웃 됨)에서 세포의 분리가 조절되지 않은 세포 확장 및 세포벽 무결성 결함으로 인해 발생하는 것으로 나타났습니다. 또한, 칼코 플루오르 염색의 패턴은 시간이 지남에 따라 변합니다. 덜 강하게 염색된 영역은 야생형의 미래 세포 확장/분지 부위와 상관관계가 있습니다. 이 방법은 세포벽을 포함하고 calcofluor로 염색 될 수있는 다른 많은 시스템에 적용될 수 있습니다.
Introduction
식물 세포벽은 세포 확장 및 발달 동안 역동적 인 변화를 겪습니다 1,2,3. 세포벽 무결성을 유지하는 것은 성장 및 발달 중 식물 세포 접착과 환경 신호에 대한 반응에 매우 중요합니다. 장기간에 걸쳐 살아있는 세포의 세포벽 역학을 시각화하는 것이 개발 및 환경 변화에 적응하는 동안 세포 접착이 유지되는 방법을 이해하는 데 중요하지만 세포벽 역학을 직접 관찰하는 현재의 방법은 여전히 어렵습니다.
세포 변화의 타임 랩스 이미징은 고해상도 형광 현미경 4,5,6,7을 사용하여 유기체의 유익한 발달 역학을 제공 할 수 있습니다. 타임랩스 3D 이미징은 성장 및 발달 중 세포 모양의 동적 변화를 연구할 수 있는 많은 잠재력을 가지고 있지만, 이 기술은 일반적으로 형광 단백질 4,5,6,7의 형질전환이 필요합니다. 그러나 대부분의 시스템에서 유전 적 변형은 시간이 많이 걸리거나 기술적으로 어렵습니다. 대안으로, 세포 성분에 부착되는 형광 염료는 오랫동안 이용 가능해왔다. 형광 염료는 특정 파장의 빛으로 조사 한 후 형광등을 방출 할 수 있습니다. 일반적인 예로는 Edu, DAPI, PI, FM4-64 및 칼코플루오르 화이트 8,9,10이 있습니다. 그러나 한 가지 주요 단점은 이러한 염료가 일반적으로 고정 조직 또는 짧은 실험에만 사용될 수 있다는 것인데, 이는 부분적으로 세포 8,9,10에 대한 피해로 인한 것입니다.
여기에 제시된 프로토콜을 사용하면 이끼 P. patens의 타임 랩스 실험 중에 칼코플루오르 화이트가 배지 내에서 혼합될 때 칼코플루오르 신호가 안정적입니다. 이 방법을 사용하여 3-D 타임 랩스 이미징을 사용하여 ggb 돌연변이 체에서 세포의 분리를 3 일 기간 동안 관찰했습니다3 (그림 1). 이 방법은 세포벽을 포함하고 calcofluor로 염색 될 수있는 다른 많은 시스템에 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
타임랩스 3D 재구성 또는 4D 이미징은 발달 과정에서 세포 형태의 역학을 관찰하기 위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜에서, 배지에서 칼코 플루오르 화이트를 혼합함으로써, 3-D 세포 형태의 역학이 이끼 P. patens에서 관찰 될 수있다. 이 방법을 사용하여 ggb 돌연변이 체의 세포벽 표면이 발달 중에 찢어지는 것을 관찰했습니다3. 또한, 세포벽의 감소된 농축은 야생?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 컨포칼 현미경에 대한 도움을 준 루이빌 대학의 Soucy Patricia 박사와 Betty Nunn 박사에게 감사를 표합니다. 이 연구는 국립 과학 재단 (MPR에 1456884)과 국립 과학 재단 협력 협정 (MPR에 1849213)에 의해 자금을 지원했습니다.
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
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