3-D time-lapse-avbildning av celleveggdynamikk ved bruk av kalkofluor i moss Physcomitrium patens
Summary
Dette manuskriptet presenterer en detaljert protokoll for å avbilde 3-D-celleveggdynamikken til levende mosevev, slik at visualisering av løsningen av cellevegger i ggb-mutanter og fortykning av celleveggmønstre i vill type under utvikling over en lang periode.
Abstract
Time-lapse-avbildning med fluorescensmikroskopi tillater observasjon av de dynamiske endringene i vekst og utvikling på cellulært og subcellulært nivå. Generelt, for observasjoner over en lang periode, krever teknikken transformasjon av et fluorescerende protein; Men for de fleste systemer er genetisk transformasjon enten tidkrevende eller teknisk utilgjengelig. Dette manuskriptet presenterer en protokoll for 3-D time-lapse-avbildning av celleveggdynamikk over en 3-dagers periode ved bruk av kalkofluorfargestoff (som flekker cellulose i plantecelleveggen), utviklet i mosen Physcomitrium patens. Kalkofluorfargesignalet fra celleveggen er stabilt og kan vare i 1 uke uten tydelig forfall. Ved hjelp av denne metoden har det vist seg at løsningen av celler i ggb-mutanter (hvor proteinet geranylgeranyltransferase-I beta-subenheten er slått ut) skyldes uregulert celleutvidelse og celleveggintegritetsdefekter. Videre endres mønstrene av kalkofluorfarging over tid; Mindre intenst fargede regioner korrelerer med fremtidige celleutvidelses- / forgreningssteder i vill type. Denne metoden kan brukes på mange andre systemer som inneholder cellevegger og som kan farges av kalkofluor.
Introduction
Plantecellevegger gjennomgår dynamiske endringer under celleutvidelse og utvikling 1,2,3. Opprettholdelse av celleveggintegritet er avgjørende for plantecelleadhesjon under vekst og utvikling, samt for respons på miljøsignaler. Selv om visualisering av celleveggdynamikk av levende celler over lang tid er avgjørende for å forstå hvordan celleadhesjon opprettholdes under utvikling og tilpasning til miljøendringer, er dagens metoder for direkte observasjon av celleveggdynamikk fortsatt utfordrende.
Time-lapse-avbildning av cellulære endringer kan gi informativ utviklingsdynamikk av en organisme ved hjelp av et høyoppløselig fluorescensmikroskop 4,5,6,7. Mens time-lapse 3-D-avbildning har stort potensial for å studere dynamiske endringer i celleform under vekst og utvikling, krever teknikken normalt transformasjon av et fluorescerende protein 4,5,6,7. Men for de fleste systemer er genetiske transformasjoner enten tidkrevende eller teknisk utfordrende. Som et alternativ har fluorescerende fargestoffer som festes til cellulære komponenter lenge vært tilgjengelige. De fluorescerende fargestoffene kan avgi fluorescerende lys etter bestråling med lys av en viss bølgelengde. Vanlige eksempler er Edu, DAPI, PI, FM4-64 og kalkofluorhvit 8,9,10. En stor ulempe er imidlertid at disse fargestoffene vanligvis bare kan brukes i fast vev eller for korte eksperimenter, delvis på grunn av skaden de forårsaker på cellen 8,9,10.
Med protokollen presentert her, er kalkofluorsignaler stabile når kalkofluorhvitt blandes i mediet under time-lapse-eksperimenter i mosen P. patens. Ved hjelp av denne metoden ble løsningen av celler i ggb-mutanter ved hjelp av 3-D time-lapse-avbildning observert over en 3-dagers periode3 (figur 1). Denne metoden kan brukes på mange andre systemer som inneholder cellevegger og som kan farges av kalkofluor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse 3-D rekonstruksjon, eller 4-D bildebehandling, er et kraftig verktøy for å observere dynamikken i cellulær morfologi under utviklingsprosesser. I denne protokollen, ved å blande kalkofluorhviten i mediet, kan dynamikken i 3-D cellulær morfologi observeres i mosen P. patens. Ved hjelp av denne metoden observerte vi at overflaten av cellevegger i ggb-mutanter blir revet fra hverandre under utvikling3. Videre er den reduserte fortykkelsen av cellevegger korrelert med…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Soucy Patricia og Betty Nunn ved University of Louisville for hjelp med konfokalmikroskopet. Dette arbeidet ble finansiert av National Science Foundation (1456884 til MPR) og av en National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 til MPR).
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
