3-D покадровая визуализация динамики клеточной стенки с использованием калькофтора в Моховом Фискомитриум Патенсе
Summary
В этой рукописи представлен подробный протокол для изображения динамики 3-D клеточной стенки живой ткани мха, что позволяет визуализировать отслоение клеточных стенок у мутантов ggb и утолщение паттернов клеточных стенок в диком типе во время развития в течение длительного периода.
Abstract
Покадровая визуализация с флуоресцентной микроскопией позволяет наблюдать динамические изменения роста и развития на клеточном и субклеточном уровнях. В целом, для наблюдений в течение длительного периода метод требует трансформации флуоресцентного белка; однако для большинства систем генетическая трансформация либо отнимает много времени, либо технически недоступна. В этой рукописи представлен протокол для 3-D покадровой визуализации динамики клеточной стенки в течение 3-дневного периода с использованием калькофторового красителя (который окрашивает целлюлозу в клеточную стенку растения), разработанного во мхе Physcomitrium patens. Сигнал калькофторового красителя от клеточной стенки стабилен и может длиться в течение 1 недели без явного распада. С помощью этого метода показано, что отслойка клеток у мутантов ggb (при которой выбавливается бета-субъединица белка геранилгеранилтрансферазы-I) вызвана нерегулируемым расширением клеток и дефектами целостности клеточной стенки. Кроме того, паттерны окрашивания калькфтором меняются с течением времени; менее интенсивно окрашенные области коррелируют с будущими участками расширения/ветвления клеток в диком типе. Этот метод может быть применен ко многим другим системам, которые содержат клеточные стенки и которые могут быть окрашены калькофтором.
Introduction
Клеточные стенки растений претерпевают динамические изменения при расширении и развитии клеток 1,2,3. Поддержание целостности клеточной стенки имеет решающее значение для адгезии растительных клеток во время роста и развития, а также для реакции на сигналы окружающей среды. Хотя визуализация динамики клеточной стенки живых клеток в течение длительного периода времени имеет решающее значение для понимания того, как клеточная адгезия поддерживается во время развития и адаптации к изменениям окружающей среды, современные методы непосредственного наблюдения динамики клеточной стенки все еще сложны.
Покадровая визуализация клеточных изменений может обеспечить информативную динамику развития организма с помощью флуоресцентного микроскопа высокого разрешения 4,5,6,7. В то время как покадровая 3D-визуализация имеет большой потенциал для изучения динамических изменений формы клеток во время роста и развития, метод обычно требует преобразования флуоресцентного белка 4,5,6,7. Однако для большинства систем генетические трансформации либо отнимают много времени, либо технически сложны. В качестве альтернативы уже давно доступны флуоресцентные красители, которые прикрепляются к клеточным компонентам. Флуоресцентные красители могут излучать флуоресцентный свет после облучения светом определенной длины волны. Распространенными примерами являются Edu, DAPI, PI, FM4-64 и кальцифтор белый 8,9,10. Одним из основных недостатков, однако, является то, что эти красители обычно могут использоваться только в фиксированной ткани или для коротких экспериментов, отчасти из-за вреда, который они наносят клетке 8,9,10.
Согласно протоколу, представленному здесь, сигналы калькофтора стабильны, когда белый калькофтор смешивается в среде во время покадровых экспериментов во мхе P. patens. Используя этот метод, отслоение клеток у мутантов ggb с использованием 3-D покадровой визуализации наблюдалось в течение 3-дневного периода3 (рисунок 1). Этот метод может быть применен ко многим другим системам, которые содержат клеточные стенки и которые могут быть окрашены калькофтором.
Protocol
Representative Results
Discussion
Покадровая 3D-реконструкция, или 4-D визуализация, является мощным инструментом для наблюдения за динамикой клеточной морфологии во время процессов развития. В этом протоколе, путем смешивания белого калькофтора в среде, динамика морфологии 3-D клеток может наблюдаться у мха P. patens. И?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят доктора Суси Патрисию и Бетти Нанн из Университета Луисвилля за помощь с конфокальным микроскопом. Эта работа финансировалась Национальным научным фондом (1456884 до M.P.R.) и Соглашением о сотрудничестве Национального научного фонда (1849213 m.P.R.).
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
