3-D time-lapse avbildning av cellväggsdynamik med hjälp av kalkofluor i mossan physcomitrium patens
Summary
Detta manuskript presenterar ett detaljerat protokoll för att avbilda 3D-cellväggsdynamiken hos levande mossvävnad, vilket möjliggör visualisering av avskiljning av cellväggar i ggb-mutanter och förtjockning av cellväggmönster i vildtypen under utveckling under en lång period.
Abstract
Time-lapse-avbildning med fluorescensmikroskopi möjliggör observation av de dynamiska förändringarna av tillväxt och utveckling på cellulära och subcellulära nivåer. I allmänhet, för observationer under en lång period, kräver tekniken omvandling av ett fluorescerande protein; Men för de flesta system är genetisk omvandling antingen tidskrävande eller tekniskt otillgänglig. Detta manuskript presenterar ett protokoll för 3-D time-lapse avbildning av cellväggsdynamik under en 3-dagarsperiod med användning av kalkofluorfärgämne (som fläckar cellulosa i växtcellväggen), utvecklat i mossan Physcomitrium patens. Kalkofluorfärgningssignalen från cellväggen är stabil och kan pågå i 1 vecka utan uppenbart sönderfall. Med hjälp av denna metod har det visats att avskiljning av celler i ggb-mutanter (där proteinet geranylgeranyltransferas-I beta-underenhet slås ut) orsakas av oreglerad cellexpansion och cellväggsintegritetsdefekter. Dessutom förändras mönstren för kalkofluorfärgning över tiden; Mindre intensivt färgade regioner korrelerar med framtida cellutvidgning / förgreningsplatser i den vilda typen. Denna metod kan tillämpas på många andra system som innehåller cellväggar och som kan färgas av kalkofluor.
Introduction
Växtcellväggar genomgår dynamiska förändringar under cellexpansion och utveckling 1,2,3. Att upprätthålla cellväggens integritet är avgörande för växtcelladhesion under tillväxt och utveckling, liksom för svaret på miljösignaler. Även om visualisering av cellväggsdynamik hos levande celler under en lång tidsperiod är avgörande för att förstå hur celladhesion upprätthålls under utveckling och anpassning till miljöförändringar, är nuvarande metoder för att direkt observera cellväggsdynamik fortfarande utmanande.
Time-lapse-avbildning av cellulära förändringar kan ge informativ utvecklingsdynamik hos en organism med hjälp av ett högupplöst fluorescensmikroskop 4,5,6,7. Medan time-lapse 3D-avbildning har stor potential för att studera dynamiska förändringar av cellform under tillväxt och utveckling, kräver tekniken normalt omvandling av ett fluorescerande protein 4,5,6,7. Men för de flesta system är genetiska omvandlingar antingen tidskrävande eller tekniskt utmanande. Som ett alternativ har fluorescerande färgämnen som fäster vid cellulära komponenter länge varit tillgängliga. De fluorescerande färgämnena kan avge fluorescerande ljus efter bestrålning med ljus av en viss våglängd. Vanliga exempel är Edu, DAPI, PI, FM4-64 och kalkofluorvit 8,9,10. En stor nackdel är dock att dessa färgämnen vanligtvis endast kan användas i fast vävnad eller för korta experiment, delvis på grund av den skada de orsakar cellen 8,9,10.
Med protokollet som presenteras här är kalkofluorsignaler stabila när kalkofluorvitt blandas i mediet under time-lapse-experiment i mossan P. patens. Med hjälp av denna metod observerades avskiljning av celler i ggb-mutanter med hjälp av 3-D time-lapse-avbildning under en 3-dagarsperiod3 (figur 1). Denna metod kan tillämpas på många andra system som innehåller cellväggar och som kan färgas av kalkofluor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse 3D-rekonstruktion, eller 4D-avbildning, är ett kraftfullt verktyg för att observera dynamiken i cellulär morfologi under utvecklingsprocesser. I detta protokoll, genom att blanda kalkofluorvitt i mediet, kan dynamiken i 3-D cellulär morfologi observeras i mossan P. patens. Med hjälp av denna metod observerade vi att ytan på cellväggar i ggb-mutanter slits sönder under utveckling3. Dessutom är den minskade förtjockningen av cellväggar korrelerad med cellexpan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr. Soucy Patricia och Betty Nunn vid University of Louisville för hjälp med konfokalmikroskopet. Detta arbete finansierades av National Science Foundation (1456884 till M.P.R.) och av ett National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 till M.P.R.).
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
