Her presenteres en protokoll for implementering av ekspansjonsmikroskopi i tidlige Drosophila-embryoer for å oppnå superoppløsningsavbildning ved hjelp av et konvensjonelt laserskanning konfokalmikroskop.
Arbeidshesten til utviklingsbiologi er det konfokale mikroskopet, som gjør det mulig for forskere å bestemme den tredimensjonale lokaliseringen av merkede molekyler i komplekse biologiske prøver. Mens tradisjonelle konfokale mikroskoper tillater en å løse to tilstøtende fluorescerende punktkilder som ligger noen hundre nanometer fra hverandre, krever observasjon av de finere detaljene i subcellulær biologi evnen til å løse signaler i størrelsesorden titalls nanometer. Tallrike maskinvarebaserte metoder for superoppløsningsmikroskopi er utviklet for å tillate forskere å omgå slike oppløsningsgrenser, selv om disse metodene krever spesialiserte mikroskoper som ikke er tilgjengelige for alle forskere. En alternativ metode for å øke oppløsningsevnen er å isotropisk forstørre prøven selv gjennom en prosess kjent som ekspansjonsmikroskopi (ExM), som først ble beskrevet av Boyden-gruppen i 2015. ExM er ikke en type mikroskopi i seg selv , men er snarere en metode for å svulme en prøve samtidig som den relative romlige organisasjonen av dets bestanddeler opprettholdes. Den utvidede prøven kan deretter observeres med en effektivt økt oppløsning ved hjelp av et tradisjonelt konfokalmikroskop. Her beskriver vi en protokoll for implementering av ExM i helmonterte Drosophila-embryoer , som brukes til å undersøke lokaliseringen av Par-3, myosin II og mitokondrier i overflateepitelcellene. Denne protokollen gir en omtrent fire ganger økning i prøvestørrelsen, noe som muliggjør deteksjon av subcellulære detaljer som ikke er synlige med konvensjonell konfokalmikroskopi. Som prinsippbevis brukes et anti-GFP-antistoff for å skille forskjellige bassenger av myosin-GFP mellom tilstøtende cellekortiker, og fluorescerende merket streptapavidin brukes til å oppdage endogene biotinylerte molekyler for å avsløre de fine detaljene i mitokondrienettverksarkitekturen. Denne protokollen bruker vanlige antistoffer og reagenser for fluorescensmerking, og den skal være kompatibel med mange eksisterende immunfluorescensprotokoller.
I celle- og utviklingsbiologi er det å se å tro, og evnen til nøyaktig å bestemme lokaliseringsmønstrene til proteiner er grunnleggende for mange typer eksperimenter. Laserskanning konfokalmikroskopi er standardverktøyet for avbildning av fluorescerende merkede proteiner i tre dimensjoner i intakte prøver. Konvensjonelle konfokale mikroskoper er ikke i stand til å skille (løse) tilstøtende fluorescerende signaler som er skilt med mindre enn halvparten av bølgelengden til lyset de avgir:1. Med andre ord må to punktkilder skilles med minst 200-300 nm i sideretningen (500-700 nm i aksial retning) for å løse dem som to forskjellige signaler. Denne tekniske barrieren er kjent som diffraksjonsgrensen, og det er en grunnleggende hindring for studier av komplekse subcellulære strukturer (f.eks. Actomyosincytoskeletal eller mitokondrielle nettverk) med romlige egenskaper under diffraksjonsgrensen. Derfor er teknikker for å øke oppløsningskraften til konvensjonelle konfokale mikroskoper av generell interesse for det biologiske samfunnet.
For å omgå diffraksjonsgrensen er det utviklet en rekke forskjellige superoppløsningsmikroskopiteknologier som muliggjør oppløsning i størrelsesordentitalls nanometer eller mindre 1,2,3, og avslører en verden av biologisk kompleksitet som tidligere bare var tilgjengelig via elektronmikroskopi. Til tross for de åpenbare fordelene med disse maskinvarebaserte metodene, har superoppløsningsmikroskoper ofte spesifikke krav til prøvemerking og lange anskaffelsestider, noe som begrenser fleksibiliteten, eller de kan ganske enkelt være for dyre for noen laboratorier å få tilgang til. Et alternativ til mikroskopbasert superoppløsning er ekspansjonsmikroskopi (ExM), som ikke er en type mikroskopi i seg selv, men snarere er en metode for å svulme en prøve samtidig som den relative romlige organisasjonen av dets bestanddeler 4 opprettholdes. De isotropisk utvidede prøvene kan deretter observeres med en effektivt økt oppløsning ved hjelp av et tradisjonelt fluorescenskonfokalmikroskop. ExM ble først beskrevet av Boyden-gruppen i 20155, og grunnteknikken har siden blitt tilpasset for bruk i en rekke eksperimenter 6,7,8. ExM har også blitt tilpasset for bruk i helmonterte embryoer, spesielt i Drosophila 9,10,11, C. elegans12 og sebrafisk 13, noe som gjør det til et kraftig verktøy for utviklingsbiologer.
ExM er basert på to forskjellige hydrogelkjemikalier: 1) svulmende polyelektrolytthydrogeler, som øker kraftig i størrelse når de er gjennomvåt i vann14, og 2) polyakrylamidhydrogeler, som har ekstremt liten polymeravstand for å tillate isotropisk prøveutvidelse15. Selv om det er mange publiserte ExM-protokoller, deler de vanligvis følgende trinn: prøvefiksering, merking, aktivering, gelering, fordøyelse og utvidelse4. Fikseringsbetingelsene og fluorescensmerkingsstrategiene vil selvfølgelig variere basert på eksperimentets og systemets behov, og i noen protokoller skjer merking etter utvidelse. Målmolekylene i prøven må primes (aktiveres) for binding til hydrogelen, som kan oppnås ved bruk av forskjellige kjemikalier4. Under geleringstrinnene blir prøven mettet med monomerer av den fremtidige hydrogelen (natriumakrylat, akrylamid og tverrbindingsbisakrylamid), og hydrogelen dannes deretter ved friradikalpolymerisasjon katalysert av en initiator, slik som ammoniumpersulfat (APS) og en akselerator, slik som tetrametylendiamin (TEMED)4. Etter gelering fordøyes prøven enzymatisk for å homogenisere prøvemotstand mot hevelse og sikre isotrop ekspansjon av hydrogelen4. Til slutt plasseres den fordøyede hydrogelen i vann, noe som får den til å utvide seg til omtrent fire ganger sin opprinnelige lineære størrelse4.
Figur 1: Oversikt over ekspansjonsmikroskopi i Drosophila-embryoer . ExM er en flertrinnsprotokoll som tar minst 4 dager å fullføre. Embryoinnsamling, fiksering og avvik tar 1 dag eller mer, avhengig av om embryoer fra flere samlinger er samlet. Immunfluorescensmerking tar 1 dag eller 2 dager, avhengig av om embryoene inkuberes over natten med de primære antistoffene. Embryoaktivering, gelering, fordøyelse og ekspansjon kan utføres på en enkelt dag. Gelene kan monteres og avbildes umiddelbart etter ekspansjon, men av praktiske årsaker er det ofte ønskelig å starte avbildningen dagen etter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Denne protokollen beskriver hvordan man utfører ExM på helmonterte Drosophila-embryoer 16 i tidlig til midtfase for å visualisere lokaliseringsmønstre for subcellulært protein ved superoppløsning (figur 1). Denne metoden bruker metylakrylsyre N-hydroksysuccinimidylester (MA-NHS) kjemi for å aktivere og forankre proteinmolekyler til hydrogelen17, og det er en modifikasjon av en tidligere publisert ExM-protokoll for bruk i sent stadium Drosophila embryoer og vev11. Denne protokollen bruker polydimetylsiloksan (PDMS) brønner for å støpe hydrogelene og lette løsningsutveksling under aktivering og gelering. En alternativ metode som ikke krever opprettelse av PDMS-brønner, innebærer å senke embryoer festet til deksler i dråper monomerløsning som sitter på et stykke laboratorieforseglingsfilm22. I tillegg beskriver denne protokollen en metode for manuelt å fjerne den ugjennomtrengelige vitellinemembranen som omgir Drosophila-embryoer , noe som er en forutsetning for immunfluorescensfarging. Det er viktig at denne metoden for håndpeeling av embryoer kan brukes til å velge bare riktig iscenesatte Drosophila-embryoer før prøvemerking, noe som øker sannsynligheten for å ende opp med utvidede prøver av riktig stadium og orientering og dermed gjør nedstrøms datainnsamling mye mer effektiv.
Manuell avvik
De fleste Drosophila-embryofikseringsprotokoller innebærer å fjerne vitellinmembranen ved å riste faste embryoer i en emulsjon av metanol og heptan, noe som får membranene til å briste av via osmotisk brudd26. Mens metanolbasert avviktellinisering (metanolpopping) er effektiv og egnet for mange applikasjoner, gir manuell avviktellinisering (håndpeeling) noen betydelige fordeler. For det første tillater håndpeeling en å velge nøyaktig iscenesatte embryoer å avvike og samle, noe som øker sannsynligheten for å oppnå utvidede embryoer i en brukbar orientering på slutten av forsøket. Denne anrikningen er kritisk når man studerer spesifikke aspekter av raske utviklingsprosesser (f.eks. Mesoderminvaginasjon eller konvergent forlengelse), for hvilke passende iscenesatte embryoer kan representere bare noen få prosent av alle embryoer, selv innenfor et tett tidsbestemt samlingsvindu. Selvfølgelig, for mange applikasjoner, vil den mer tradisjonelle bulkmetanolpopping av embryoer fra et tidsbestemt innsamlingsvindu være tilstrekkelig, og håndpeeling er kanskje ikke verdt den ekstra innsatsen. For det andre påvirkes bindingen av visse primære antistoffer og fargestoffer negativt av tidligere eksponering av prøven for metanol. Av denne grunn kan håndpeeling gi betydelige økninger i immunfluorescenssignalkvaliteten sammenlignet med metanolpoppprøver, noe som gjør det til en nyttig generell teknikk for Drosophila utviklingsbiologer.
Høyoppløselig konfokalmikroskopi i utvidede helmonterte Drosophila-embryoer
Mens utførelse av høyoppløselig konfokalmikroskopi på utvidede prøver er konseptuelt det samme som på uutvidede prøver, introduserer ExM noen tekniske hindringer. Spesielt blir embryoorientering, som er tilfeldig, enda viktigere når prøvestørrelsen øker, fordi høyforstørrelse, høy-NA-mål bare er i stand til å fokusere lys fra prøveområder som er svært nær dekselet27. Derfor er det vanligvis bare mulig å fokusere på cellene på eller nær overflaten av embryoet som endte opp ved siden av dekselet da gelen ble dannet. Den beste måten å sikre at det er prøver av riktig orientering på slutten, er å starte ExM-protokollen med en tett iscenesatt samling av faste embryoer (f.eks. ved å bruke håndpeeling) og å frø mange embryoer i hver brønn (>10). For å visualisere celler dypt inne i embryoet, kan det være nødvendig å benytte mer spesialiserte bildeoppsett, for eksempel lysarkmikroskopi28. I tillegg finner vi at bildekvaliteten kan forbedres ved å åpne det konfokale pinhole til en størrelse større enn en luftig enhet. Selvfølgelig vil en økt pinhole størrelse komme på bekostning av redusert maksimal oppløsning, men i praksis kan selv små økninger i pinhole størrelse øke signalintensiteten betydelig (data ikke vist). Fremtidige studier bør systematisk adressere pinhole størrelse og effektiv oppløsning i ExM-prøver.
Variasjoner over grunnleggende ExM
Protokollen beskrevet her er et relativt enkelt eksempel på ExM som skal fungere for mange applikasjoner og være enkel å implementere i de fleste utviklingsbiologiske laboratorier. Imidlertid er det mange variasjoner på det grunnleggende konseptet med ExM 4,5,7 som kan brukes til å øke signalintensiteten, oppnå enda flere ekspansjonsgrader og oppdage nukleinsyremolekyler så vel som proteiner. I denne protokollen inkuberes embryoene med antistoffer før gelering og ekspansjon. Alternativt kan prøvene behandles med antistoffer etter at de er utvidet 6,30, noe som kan øke signalintensiteten på grunn av økt epitoptilgjengelighet og redusert tap av bundne antistoffer under ekspansjonstrinnene. I tillegg kan spesifikke tverrbindingsmolekyler brukes til å feste RNA-molekyler til hydrogelen for å tillate deteksjon av RNA i ekspanderte geler ved bruk av hybridiseringskjedereaksjonsmetoden30. Til slutt kan prøvene bli utsatt for flere ekspansjonsrunder, som i iterativ ekspansjonsmikroskopi (iExM)31, pan-ExM32 og ekspansjonsavslørende (ExR)31, for å oppnå enda høyere grader av økt oppløsning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Dr. Jennifer Zallen for å gi marsvin anti-Par-3 primære antistoff. Dette arbeidet ble støttet av sjenerøs finansiering (1R15GM143729-01 og 1P20GM139768-01 5743) fra National Institute of General Medical Science (NIGMS), et av medlemmene i National Institutes of Health (NIH), samt Arkansas Biosciences Institute (ABI), som ga delvis finansiering for kjøp av vårt konfokale mikroskop.
acrylamide | Milipore Sigma | 1490-100ML | |
ammonium persulfate | VWR | BDH9214-500G | |
anti-GFP rabbit polyclonal antibody | Torrey Pines BioLabs | TP-401 | |
anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11075 | |
anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
bisacrylamide | Research Products International | A11275 | |
bovine serum albumin (30% solution) | Millipore Sigma | A7284 | |
conical tubes, 50 mL | fisherscientific | 21008-940 | |
coverlip glass, square 22 mm | VWR | 48366-227 | |
coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm | VWR | 48393-230 | |
glass capillaries for pulling needles | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
glass microinjection needles (pre-pulled) | World Precision Instruments | TIP10LT | |
guanidine HCl | VWR | 101970-606 | |
heptane | VWR | EM-HX0078-1 | |
latex pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester | VWR | 730300-1G | |
microfuge tube, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
multi-well plate, 6-well | Genesee | 25-100 | |
paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free) | Electron Microscopy Sciences | 509804487 (Fisher) | |
Pasteur pipet (2 mL, short tip) | VWR | 14673-010 | |
PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent) | VWR | 102092-312 | |
Petri plates | Genesee | 32-107 | |
phosphate-buffered saline (10x solution) | VWR | 97063-660 | |
Poly-L-lysine solution (0.1% solution) | VWR | P8920-1ooML | |
Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | E00491 | |
scintillation vials (30 mL) | VWR | 66022-128 | |
sodium acrylate | VWR | 101181-226 | |
sodium azide (powder) | Millipore Sigma | 71289 | make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration! |
Streptavidin, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | S32354 | |
TAE (50x) | VWR | 97063-692 | |
tape (double-sided, 1 inch wide) | Scotch 3M | 665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed | |
TEMED | Thermo Fisher Scientific | PI17919 | |
TEMPO | VWR | EM8.14681.0005 | catalytic oxidant |
Tween-20 | VWR | 97063-872 | extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water |
Zeiss LSM 900 | Zeiss | Laser scanning microscope used without AiryScan |