मेकानो-नोड-पोर सेंसिंग: मल्टी-पैरामीटर सिंगल-सेल विस्कोस्टिक माप के लिए एक रैपिड, लेबल-फ्री प्लेटफॉर्म
Summary
यहां प्रस्तुत इलेक्ट्रॉनिक्स-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करके एकल कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से फेनोटाइप करने की एक विधि है जिसे मेकानो-नोड-पोर सेंसिंग (मेकानो-एनपीएस) कहा जाता है। यह मंच कोशिकाओं के लोचदार और चिपचिपे बायोफिज़िकल गुणों दोनों को मापते हुए 1-10 कोशिकाओं / सेकंड के मध्यम थ्रूपुट को बनाए रखता है।
Abstract
सेलुलर यांत्रिक गुण विभिन्न प्रकार की जैविक प्रक्रियाओं और बीमारियों में शामिल हैं, स्टेम सेल भेदभाव से लेकर कैंसर मेटास्टेसिस तक। इन गुणों को मापने के लिए पारंपरिक तरीके, जैसे परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) और माइक्रोपिपेट एस्पिरेशन (एमए), समृद्ध जानकारी कैप्चर करते हैं, जो सेल की पूर्ण विस्कोस्टिक प्रतिक्रिया को दर्शाते हैं; हालाँकि, ये विधियाँ बहुत कम थ्रूपुट द्वारा सीमित हैं। उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण, जैसे कि वास्तविक समय की विकृति साइटोमेट्री (आरटी-डीसी), केवल सीमित यांत्रिक जानकारी को माप सकते हैं, क्योंकि वे अक्सर एकल-पैरामीटर रीडआउट तक सीमित होते हैं जो केवल सेल के लोचदार गुणों को दर्शाते हैं। इन विधियों के विपरीत, मेकानो-नोड-पोर सेंसिंग (मेकानो-एनपीएस) एक लचीला, लेबल-मुक्त माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म है जो मध्यम थ्रूपुट वाले सेल के बहु-पैरामीटर विस्कोस्टिक माप प्राप्त करने में अंतर को पाटता है। एक प्रत्यक्ष धारा (डीसी) माप का उपयोग कोशिकाओं की निगरानी के लिए किया जाता है क्योंकि वे एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को पारगमन करते हैं, उनके आकार और वेग को एक संकीर्ण कसना के माध्यम से मजबूर करने से पहले, दौरान और बाद में ट्रैक करते हैं। इस जानकारी (यानी, आकार और वेग) का उपयोग प्रत्येक सेल के अनुप्रस्थ विरूपण, विरूपण के प्रतिरोध और विरूपण से वसूली को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। सामान्य तौर पर, यह इलेक्ट्रॉनिक्स-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म कई विस्कोस्टिक सेल गुण प्रदान करता है, और इस प्रकार सेल की यांत्रिक स्थिति की अधिक पूर्ण तस्वीर प्रदान करता है। क्योंकि इसके लिए न्यूनतम नमूना तैयार करने की आवश्यकता होती है, एक सरल इलेक्ट्रॉनिक माप (उच्च गति वाले कैमरे के विपरीत) का उपयोग करता है, और मानक नरम लिथोग्राफी निर्माण का लाभ उठाता है, इस मंच का कार्यान्वयन सरल, सुलभ और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए अनुकूलनीय है। इस प्लेटफ़ॉर्म के लचीलेपन, उपयोगिता और संवेदनशीलता ने कोशिकाओं की एक विविध श्रृंखला पर अद्वितीय यांत्रिक जानकारी प्रदान की है, जिसमें बुनियादी विज्ञान और नैदानिक निदान में कई और अनुप्रयोगों की क्षमता है।
Introduction
एकल कोशिकाएं गतिशील, विस्कोस्टिक सामग्रीहैं 1. आंतरिक और बाहरी प्रक्रियाओं की एक भीड़, (उदाहरण के लिए, माइटोसिस की शुरुआत या बाह्य मैट्रिक्स [ईसीएम] की रीमॉडेलिंग), उनकी संरचना और संरचना 2,3,4 को प्रभावित करती है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर अलग-अलग बायोफिज़िकल गुण होते हैं जो उनकी वर्तमान स्थिति के पूरक होते हैं। विशेष रूप से, यांत्रिक गुणों को सेलुलर विकास, शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान के महत्वपूर्ण बायोमार्कर के रूप में दिखाया गया है, जो मूल्यवान मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है जो कैननिकल आणविक और आनुवंशिक दृष्टिकोण 5,6,7 को पूरक कर सकता है। उदाहरण के लिए, ली एट अल ने हाल ही में दवा प्रतिरोधी और दवा-उत्तरदायी तीव्र प्रोमाइलोसाइटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के बीच यांत्रिक अंतर का वर्णन किया, जबकि अलग-अलग व्यक्त साइटोस्केलेटन से जुड़े जीन 8 को उजागर करने के लिए आरएनए-सेक का भी उपयोगकिया। एकल-कोशिका यांत्रिकी और सेलुलर फ़ंक्शन के बीच जटिल अंतःक्रिया को समझकर, मेकेनोटाइपिंग में बुनियादी विज्ञान और नैदानिक निदान को बदलने में व्यापकअनुप्रयोग हैं।
एकल-कोशिका यांत्रिकी को मापने के लिए सबसे व्यापक रूप से अपनाया जाने वाला उपकरण परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) है। जबकि एएफएम सेलुलर यांत्रिक गुणों के एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन, स्थानीय माप को सक्षम बनाता है, यह <0.01 कोशिकाओं / एस10 के थ्रूपुट तक सीमित रहता है। वैकल्पिक रूप से, ऑप्टिकल स्ट्रेचर, जो निलंबित एकल कोशिकाओं11 को फंसाने और विकृत करने के लिए दो डाइवर्जेंट लेजर बीम का उपयोग करते हैं, <1 सेल / एस12 के मामूली उच्च थ्रूपुट तक सीमित हैं। माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों में हालिया प्रगति ने तेजी से, एकल-सेल, यांत्रिक मूल्यांकन12,13 के लिए उपकरणों की एक नई पीढ़ी को सक्षम किया है। येतकनीकें संकीर्ण कसना चैनल 14,15, कतरनी प्रवाह16, या हाइड्रोडायनामिक स्ट्रेचिंग17 को 10-1,000 कोशिकाओं / एस18 के थ्रूपुट पर कोशिकाओं को जल्दी से विकृत करने के लिए नियोजित करती हैं। जबकि इन दृष्टिकोणों की माप दर पारंपरिक तकनीकों की तुलना में काफी तेज है, वे अक्सर सीमित यांत्रिक रीडआउट (पूरक तालिका 1) के लिए उच्च-थ्रूपुट क्षमताओं का व्यापार करते हैं। उपरोक्त सभी रैपिड माइक्रोफ्लुइडिक विधियां बुनियादी, एकल-पैरामीटर मैट्रिक्स पर ध्यान केंद्रित करती हैं, जैसे कि पारगमन समय या विकृति अनुपात, जो केवल सेल के लोचदार गुणों को दर्शाते हैं। हालांकि, एकल कोशिकाओं की आंतरिक विस्कोस्टिक प्रकृति को देखते हुए, कोशिकाओं के एक मजबूत और गहन यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए न केवल लोचदार घटकों बल्कि चिपचिपे प्रतिक्रियाओं पर भी विचार करने की आवश्यकता होती है।
मेकानो-नोड-पोर सेंसिंग (मेकानो-एनपीएस) 2,8 (चित्रा 1 ए) एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म है जो एकल-सेल मेकेनोफेनोटाइपिंग के साथ मौजूदा सीमाओं को संबोधित करता है। यह विधि एक साथ कई बायोफिज़िकल मापदंडों के माप को सक्षम करती है, जिसमें सेल व्यास, सापेक्ष विकृति और विरूपण से वसूली का समय शामिल है, जिसमें 1-10 कोशिकाओं / सेकंड का मध्यम थ्रूपुट होता है। यह तकनीक नोड-पोर सेंसिंग (एनपीएस) 19,20,21,22,23,24 पर आधारित है, जिसमें एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को स्थानांतरित करने वाले सेल द्वारा उत्पादित मॉड्यूलेटेड करंट पल्स को मापने के लिए चार-बिंदु जांच माप का उपयोग करना शामिल है, जिसे व्यापक क्षेत्रों द्वारा विभाजित किया गया है, जिसे “नोड्स” कहा जाता है। मॉड्यूलेटेड करंट पल्स सेल का एक परिणाम है जो खंडों (यानी, “छिद्र”) और नोड्स में धारा के प्रवाह को आंशिक रूप से अवरुद्ध करता है, जिसमें उत्तरार्द्ध की तुलना में पूर्व में अधिक प्रवाह अवरुद्ध होता है। मेकानो-एनपीएस में, एक खंड, “संकुचन चैनल”, सेल व्यास की तुलना में संकरा है; नतीजतन, एक सेल को पूरे चैनल को स्थानांतरित करने के लिए विकृत करना होगा (चित्रा 1 बी)। सेल व्यास को उप-स्पंदन के परिमाण से निर्धारित किया जा सकता है जब सेल संकुचन चैनल से पहले नोड-छिद्रों को स्थानांतरित करता है (आंकड़े 1 बी, सी)। यहां, जब कोशिका छिद्र में होती है, तो वर्तमान गिरावट, छिद्र में कोशिका के आयतन अनुपात केसमानुपाती होती है, वीसेल / वीपोर 2,8,19। सेल कठोरता को एटीसी द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, नाटकीय रूप से बड़े उप-स्पंदन की अवधि जब सेल संकुचन चैनल को पारगमन करता है (आंकड़े 1 बी, सी)। एक कठोर सेल को चैनल को स्थानांतरित करने मेंनरम 2,8 की तुलना में अधिक समय लगेगा। अंत में, सेल “रिकवरी”, विरूपण के बाद अपने मूल आकार और आकार में लौटने की सेल की क्षमता, उत्पादित उप-दालों की श्रृंखला द्वारा निर्धारित की जा सकती है क्योंकि सेल संकुचन चैनल के बाद नोड-छिद्रों को स्थानांतरित करता है (आंकड़े 1 बी, सी)। रिकवरी का समय, एफटीआर, वह समय है जो सेल को निचोड़ने से पहले, वर्तमान उप-दालों को पिछली उप-दालों के परिमाण में लौटने में लगता है। कुल मिलाकर, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को स्थानांतरित करने वाले सेल के रूप में उत्पादित मॉड्यूलेटेड वर्तमान दालों को रिकॉर्ड किया जाता है और प्रासंगिक एकल-सेल यांत्रिक मापदंडों (चित्रा 1 डी) 2,8 को निकालने के लिए विश्लेषण किया जाता है।
इस इलेक्ट्रॉनिक्स-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म की प्रजनन क्षमता और उपयोग में आसानी पहले प्रदर्शित की गईहै। इसके अतिरिक्त, मंच एकल-सेल मेकेनोटाइपिंग के लिए प्रवेश के लिए एक कम बाधा प्रस्तुत करता है। मानक नरम लिथोग्राफी माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को बनाने के लिए नियोजित है। माप हार्डवेयर में एक साधारण मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी), बिजली की आपूर्ति, प्रीएम्पलीफायर, डेटा अधिग्रहण बोर्ड (डीएक्यू), और कंप्यूटर सहित सस्ती घटक शामिल हैं। अंत में, उपयोगकर्ता के अनुकूल कोड डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए उपलब्ध है, जो सीधे कार्यान्वयन को सक्षम करता है। यह मेकेनोटाइपिंग तकनीक गैर-घातक और घातक स्तन और फेफड़ों के उपकला कोशिका लाइनों की आबादी को अलग कर सकती है, प्राथमिक मानव स्तन उपकला कोशिकाओं में उपवंशों के बीच भेदभाव कर सकती है, और साइटोस्केलेटल गड़बड़ी और अन्य औषधीय एजेंटोंके प्रभावों को चिह्नित कर सकती है। कुल मिलाकर, यह मंच एकल कोशिकाओं के मेकेनोफेनोटाइपिंग के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस मेकेनोटाइपिंग तकनीक का उपयोग करके एकल कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को मापने में तीन चरण होते हैं: डिवाइस निर्माण, डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण। प्रत्येक चरण के भीतर, उल्लेखनीय पहलू हैं जो प्रयोगात?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को एनआईबीआईबी 1 आर 01ईबी 024989-01 और एनसीआई 1 आर 01 सीए 190843-01 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। ए एल और आर आर को एच 2 एच 8 एसोसिएशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। केएलसी को नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप और सिबेल स्कॉलर फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Acetone | J.T. Baker | 5356-05 | Purity (GC) ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker) |
| Aluminum Foil | n/a | n/a | |
| Analog Low-Pass Filter | ThorLabs | EF504 | ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
| Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25) |
| Blade | n/a | n/a | |
| BNC Cable | Pomona Electronics | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
| Cleanroom Polyester Swab | Thermo Fisher Scientific | 18383 | https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 |
| Current Preamplifier | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419 |
| Custom PCB (w/ components) | n/a | n/a | see Supplemental files 4 and 5 |
| DAQ Terminal Block | National Instruments | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
| DAQ to BNC-2110 cable | National Instruments | SHC68-68-EPM | https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html |
| Data Acquisition Board (DAQ) | National Instruments | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
| Dessicator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 |
| Female BNC To Banana Plug Adapter | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
| Glass Cutter | Chemglass | CG-1179-21 | https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips |
| Gold Etchant TFA | Transene | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
| Hot Plate | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
| Isopropyl Alcohol | Spectrum Chemical | I1056-4LTPL | Purity (GC) ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056) |
| Metal Hardware Enclosure | Hammond Manufacturing | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Purity (GC) ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561) |
| MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
| MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist | DuPont | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
| Photomask | Fineline Imaging | n/a | Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/) |
| Plain Glass Microscope Slide | Fisher Scientific | 12-553-5B | Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/ |
| Plastic Petri Dish | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712) |
| Pressure Controller | Fluigent | MFCS-EZ | https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/ |
| Pressure Controller Software | Fluigent | MAESFLO | |
| Programming & Computation Software | MATLAB | R2021b | for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html) |
| PTFE Tubing | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
| Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
| Silicon Wafer | Wafer World | 2885 | 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885) |
| Spin Coater | n/a | n/a | |
| SU-8 3025 Negative Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
| SU8 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
| Sygard 184 Polydimethlysiloxane | Dow Chemical | 4019862 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Tape | Scotch | 810-341296 | https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB |
| Titanium, Platinum, Gold | n/a | n/a | |
| Triple Output Power Supply | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
| UV Mask Aligner | Karl Suss America | MJB3 Mask Aligner |
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