Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen
Summary
Hier wird eine Methode zur mechanischen Phänotypisierung einzelner Zellen unter Verwendung einer elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform namens Mechano-Node-Pore Sensing (Mechano-NPS) vorgestellt. Diese Plattform hält einen moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s aufrecht und misst gleichzeitig die elastischen und viskosen biophysikalischen Eigenschaften der Zellen.
Abstract
Zelluläre mechanische Eigenschaften sind an einer Vielzahl von biologischen Prozessen und Krankheiten beteiligt, die von der Stammzelldifferenzierung bis zur Krebsmetastasierung reichen. Herkömmliche Methoden zur Messung dieser Eigenschaften, wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Mikropipettenaspiration (MA), erfassen reichhaltige Informationen, die die volle viskoelastische Reaktion einer Zelle widerspiegeln. Diese Methoden sind jedoch durch einen sehr geringen Durchsatz begrenzt. Hochdurchsatzansätze wie die Echtzeit-Deformierbarkeitszytometrie (RT-DC) können nur begrenzte mechanische Informationen messen, da sie oft auf Einzelparameter-Anzeigen beschränkt sind, die nur die elastischen Eigenschaften einer Zelle widerspiegeln. Im Gegensatz zu diesen Methoden ist die Mechano-Node-Poren-Sensorik (Mechano-NPS) eine flexible, markierungsfreie mikrofluidische Plattform, die die Lücke schließt, um multiparameter-viskoelastische Messungen einer Zelle mit moderatem Durchsatz zu erreichen. Eine Gleichstrommessung (DC) wird verwendet, um Zellen zu überwachen, während sie einen mikrofluidischen Kanal durchlaufen, und verfolgt ihre Größe und Geschwindigkeit vor, während und nachdem sie durch eine enge Verengung gezwungen werden. Diese Informationen (d. H. Größe und Geschwindigkeit) werden verwendet, um die transversale Verformung jeder Zelle, den Widerstand gegen Verformung und die Erholung von der Verformung zu quantifizieren. Im Allgemeinen bietet diese elektronikbasierte mikrofluidische Plattform mehrere viskoelastische Zelleigenschaften und damit ein vollständigeres Bild des mechanischen Zustands einer Zelle. Da sie eine minimale Probenvorbereitung erfordert, eine einfache elektronische Messung (im Gegensatz zu einer Hochgeschwindigkeitskamera) verwendet und die Vorteile der Standard-Softlithographie-Fertigung nutzt, ist die Implementierung dieser Plattform einfach, zugänglich und an die nachgelagerte Analyse anpassbar. Die Flexibilität, der Nutzen und die Empfindlichkeit dieser Plattform haben einzigartige mechanische Informationen zu einer Vielzahl von Zellen geliefert, mit dem Potenzial für viele weitere Anwendungen in der Grundlagenforschung und klinischen Diagnostik.
Introduction
Einzelzellen sind dynamische, viskoelastische Materialien1. Eine Vielzahl von internen und externen Prozessen (z. B. Beginn der Mitose oder Umbau der extrazellulären Matrix [ECM]) beeinflussen ihre Struktur und Zusammensetzung 2,3,4, was oft zu unterschiedlichen biophysikalischen Eigenschaften führt, die ihren aktuellen Zustand ergänzen. Insbesondere mechanische Eigenschaften haben sich als wichtige Biomarker für die Zellentwicklung, Physiologie und Pathologie erwiesen und liefern wertvolle quantitative Informationen, die kanonische molekulare und genetische Ansätze ergänzen können 5,6,7. Zum Beispiel beschrieben Li et al. kürzlich die mechanischen Unterschiede zwischen arzneimittelresistenten und medikamentenresponsiven akuten promyelozytären Leukämiezellen, während sie auch RNA-seq verwendeten, um differentiell exprimierte Zytoskelett-assoziierte Gene aufzudecken8. Durch das Verständnis des komplexen Zusammenspiels zwischen Einzelzellmechanik und Zellfunktion hat die Mechanophänotypisierung breitere Anwendungen bei der Transformation der Grundlagenforschung und der klinischen Diagnostik9.
Das am weitesten verbreitete Werkzeug zur Messung der Einzelzellmechanik ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM). Während AFM eine hochauflösende, lokalisierte Messung zellulärer mechanischer Eigenschaften ermöglicht, bleibt es auf einen Durchsatz von <0,01 Zellen/sbegrenzt 10. Alternativ sind optische Stretcher, die zwei divergente Laserstrahlen verwenden, um suspendierte Einzelzellen11 einzufangen und zu verformen, auf geringfügig höhere Durchsätze von <1 Zelle/n12 beschränkt. Jüngste Fortschritte in der mikrofluidischen Technologie haben eine neue Generation von Geräten für die schnelle, einzellige, mechanische Bewertung ermöglicht12,13. Diese Techniken verwenden enge Verengungskanäle14,15, Scherströmung16 oder hydrodynamische Dehnung 17, um Zellen bei Durchsätzen von 10-1.000 Zellen / s 18 schnell zu verformen. Während die Messrate dieser Ansätze wesentlich schneller ist als bei herkömmlichen Techniken, tauschen sie häufig Hochdurchsatzfähigkeiten gegen begrenzte mechanische Auslesungen aus (Zusatztabelle 1). Alle oben genannten schnellen mikrofluidischen Methoden konzentrieren sich auf grundlegende Einzelparametermetriken wie Transitzeit oder Verformbarkeitsverhältnisse, die nur die elastischen Eigenschaften einer Zelle widerspiegeln. Angesichts der intrinsischen viskoelastischen Natur einzelner Zellen erfordert eine robuste und gründliche mechanische Charakterisierung von Zellen jedoch nicht nur die Berücksichtigung elastischer Komponenten, sondern auch viskoser Reaktionen.
Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)2,8 (Abbildung 1A) ist eine mikrofluidische Plattform, die bestehende Einschränkungen bei der Einzelzell-Mechanophänotypisierung adressiert. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung mehrerer biophysikalischer Parameter, einschließlich Zelldurchmesser, relativer Verformbarkeit und Erholungszeit von Verformung, mit einem moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s. Diese Technik basiert auf Node-Pore Sensing (NPS) 19,20,21,22,23,24, bei der eine Vier-Punkt-Sondenmessung verwendet wird, um den modulierten Stromimpuls zu messen, der von einer Zelle erzeugt wird, die einen mikrofluidischen Kanal durchquert, der durch breitere Regionen, sogenannte “Knoten”, segmentiert wurde. Der modulierte Stromimpuls ist das Ergebnis der teilweisen Blockierung des Stromflusses in den Segmenten (d. H. “Poren”) und Knoten, wobei in ersteren mehr Strom blockiert wird als in letzteren. Beim Mechano-NPS ist ein Segment, der “Kontraktionskanal”, schmaler als ein Zelldurchmesser; Folglich muss sich eine Zelle verformen, um den gesamten Kanal zu durchlaufen (Abbildung 1B). Der Zelldurchmesser kann durch die Größe des Subpulses bestimmt werden, der erzeugt wird, wenn die Zelle die Knotenporen vor dem Kontraktionskanal durchquert (Abbildungen 1B,C). Hier ist |ΔInp|, der Stromabfall, wenn sich die Zelle in der Pore befindet, proportional zum Volumenverhältnis der Zelle zur Pore, V-Zelle/V-Pore 2,8,19. Die Zellsteifigkeit kann durch ΔTc bestimmt werden, die Dauer des dramatisch größeren Subpulses, der entsteht, wenn die Zelle den Kontraktionskanal durchquert (Abbildungen 1B,C). Eine steifere Zelle braucht länger, um den Kanal zu passieren als eine weichere 2,8. Schließlich kann die Zellerholung, die Fähigkeit der Zelle, nach der Verformung zu ihrer ursprünglichen Größe und Form zurückzukehren, durch die Reihe von Subpulsen bestimmt werden, die erzeugt werden, wenn die Zelle die Knotenporen nach dem Kontraktionskanal durchquert (Abbildungen 1B,C). Die Erholungszeit, ΔTr, ist die Zeit, die benötigt wird, bis die aktuellen Subpulse wieder die Größe der vorherigen Subpulse erreichen, bevor die Zelle gequetscht wird. Insgesamt werden die modulierten Stromimpulse, die erzeugt werden, wenn eine Zelle den mikrofluidischen Kanal durchquert, aufgezeichnet und analysiert, um die relevanten mechanischen Einzelzellparameter zu extrahieren (Abbildung 1D)2,8.
Die Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit dieser elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform wurde bereits nachgewiesen25. Darüber hinaus bietet die Plattform eine niedrige Eintrittsbarriere für die Einzelzell-Mechanophänotypisierung. Standard-Softlithographie wird verwendet, um mikrofluidische Geräte herzustellen. Die Messhardware besteht aus kostengünstigen Komponenten, darunter eine einfache Leiterplatte (PCB), ein Netzteil, ein Vorverstärker, eine Datenerfassungsplatine (DAQ) und ein Computer. Schließlich steht benutzerfreundlicher Code für die Datenerfassung und -analyse zur Verfügung, der eine einfache Implementierung ermöglicht. Diese Mechanophänotypisierungstechnik kann Populationen von nicht-malignen und malignen Brust- und Lungenepithelzelllinien unterscheiden, zwischen Unterlinien in primären menschlichen Brustepithelzellen unterscheiden und die Auswirkungen von Zytoskelettstörungen und anderen pharmakologischen Wirkstoffen charakterisieren 2,8. Insgesamt ist diese Plattform ein effektiver Ansatz für die Mechanophänotypisierung einzelner Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Messung der mechanischen Eigenschaften einzelner Zellen mit dieser Mechanophänotypisierungstechnik besteht aus drei Phasen: Geräteherstellung, Datenerfassung und Datenanalyse. Innerhalb jeder Phase gibt es bemerkenswerte Aspekte, die die experimentellen Ergebnisse erheblich beeinflussen können. Bei der Geräteherstellung sind konsistente Kanalgeometrien und die Einheitlichkeit von Gerät zu Gerät für genaue und wiederholbare Ergebnisse unerlässlich. Insbesondere sollten die Seitenwände jedes Geräts relativ gl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch Zuschüsse von NIBIB 1R01EB024989-01 und NCI 1R01CA190843-01 unterstützt. A. L. und R. R. wurden durch ein H2H8 Association Graduate Research Fellowship unterstützt. K. L. C. wurde durch ein National Science Foundation Graduate Research Fellowship und ein Siebel Scholar Fellowship unterstützt.
Materials
| Acetone | J.T. Baker | 5356-05 | Purity (GC) ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker) |
| Aluminum Foil | n/a | n/a | |
| Analog Low-Pass Filter | ThorLabs | EF504 | ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
| Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25) |
| Blade | n/a | n/a | |
| BNC Cable | Pomona Electronics | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
| Cleanroom Polyester Swab | Thermo Fisher Scientific | 18383 | https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 |
| Current Preamplifier | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419 |
| Custom PCB (w/ components) | n/a | n/a | see Supplemental files 4 and 5 |
| DAQ Terminal Block | National Instruments | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
| DAQ to BNC-2110 cable | National Instruments | SHC68-68-EPM | https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html |
| Data Acquisition Board (DAQ) | National Instruments | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
| Dessicator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 |
| Female BNC To Banana Plug Adapter | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
| Glass Cutter | Chemglass | CG-1179-21 | https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips |
| Gold Etchant TFA | Transene | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
| Hot Plate | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
| Isopropyl Alcohol | Spectrum Chemical | I1056-4LTPL | Purity (GC) ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056) |
| Metal Hardware Enclosure | Hammond Manufacturing | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Purity (GC) ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561) |
| MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
| MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist | DuPont | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
| Photomask | Fineline Imaging | n/a | Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/) |
| Plain Glass Microscope Slide | Fisher Scientific | 12-553-5B | Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/ |
| Plastic Petri Dish | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712) |
| Pressure Controller | Fluigent | MFCS-EZ | https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/ |
| Pressure Controller Software | Fluigent | MAESFLO | |
| Programming & Computation Software | MATLAB | R2021b | for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html) |
| PTFE Tubing | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
| Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
| Silicon Wafer | Wafer World | 2885 | 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885) |
| Spin Coater | n/a | n/a | |
| SU-8 3025 Negative Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
| SU8 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
| Sygard 184 Polydimethlysiloxane | Dow Chemical | 4019862 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Tape | Scotch | 810-341296 | https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB |
| Titanium, Platinum, Gold | n/a | n/a | |
| Triple Output Power Supply | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
| UV Mask Aligner | Karl Suss America | MJB3 Mask Aligner |
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