Summary

Mechano-Node-Pore Sensing: En snabb, etikettfri plattform för encells viskoelastiska mätningar med flera parametrar

Published: December 02, 2022
doi:

Summary

Här presenteras en metod för att mekaniskt fenotypa enstaka celler med hjälp av en elektronikbaserad mikrofluidisk plattform som kallas mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Denna plattform upprätthåller måttlig genomströmning av 1-10 celler / s samtidigt som man mäter både de elastiska och viskösa biofysiska egenskaperna hos celler.

Abstract

Cellulära mekaniska egenskaper är involverade i en mängd olika biologiska processer och sjukdomar, allt från stamcellsdifferentiering till cancermetastaser. Konventionella metoder för att mäta dessa egenskaper, såsom atomkraftsmikroskopi (AFM) och mikropipettaspiration (MA), fångar rik information, vilket återspeglar en cells fullständiga viskoelastiska svar; Dessa metoder begränsas dock av mycket låg genomströmning. Metoder med hög genomströmning, till exempel RT-DC (Deformerability Cytometry i realtid), kan bara mäta begränsad mekanisk information, eftersom de ofta är begränsade till avläsningar med en parameter som bara återspeglar en cells elastiska egenskaper. I motsats till dessa metoder är mekano-nod-poravkänning (mekano-NPS) en flexibel, etikettfri mikrofluidisk plattform som överbryggar klyftan för att uppnå viskoelastiska mätningar med flera parametrar av en cell med måttlig genomströmning. En likströmsmätning (DC) används för att övervaka celler när de passerar en mikrofluidisk kanal och spårar deras storlek och hastighet före, under och efter att de tvingas genom en smal förträngning. Denna information (dvs. storlek och hastighet) används för att kvantifiera varje cells tvärgående deformation, motståndskraft mot deformation och återhämtning från deformation. I allmänhet ger denna elektronikbaserade mikrofluidiska plattform flera viskoelastiska cellegenskaper och därmed en mer komplett bild av en cells mekaniska tillstånd. Eftersom det kräver minimal provberedning, använder en enkel elektronisk mätning (i motsats till en höghastighetskamera) och utnyttjar standard mjuklitografitillverkning, är implementeringen av denna plattform enkel, tillgänglig och anpassningsbar till nedströmsanalys. Denna plattforms flexibilitet, användbarhet och känslighet har gett unik mekanisk information om ett brett spektrum av celler, med potential för många fler applikationer inom grundvetenskap och klinisk diagnostik.

Introduction

Enstaka celler är dynamiska, viskoelastiska material1. En mängd interna och externa processer (t.ex. mitos eller ombyggnad av den extracellulära matrisen [ECM]), påverkar deras struktur och sammansättning 2,3,4, vilket ofta resulterar i distinkta biofysiska egenskaper som kompletterar deras nuvarande tillstånd. I synnerhet har mekaniska egenskaper visat sig vara viktiga biomarkörer för cellulär utveckling, fysiologi och patologi, vilket ger värdefull kvantitativ information som kan komplettera kanoniska molekylära och genetiska tillvägagångssätt 5,6,7. beskrev till exempel nyligen de mekaniska skillnaderna mellan läkemedelsresistenta och läkemedelsresponsiva akuta promyelocytiska leukemiceller, samtidigt som de använde RNA-seq för att avslöja differentiellt uttryckta cytoskelettassocierade gener8. Genom att förstå det komplexa samspelet mellan encellsmekanik och cellulär funktion har mekanofenotypning bredare tillämpningar för att omvandla grundvetenskap och klinisk diagnostik9.

Det mest använda verktyget för att mäta encellsmekanik är atomkraftmikroskopi (AFM). Medan AFM möjliggör en högupplöst, lokaliserad mätning av cellulära mekaniska egenskaper, förblir den begränsad till en genomströmning på <0,01 celler / s10. Alternativt är optiska bårar, som använder två divergerande laserstrålar för att fånga och deformera suspenderade enstaka celler11, begränsade till marginellt högre genomströmningar av <1 cell / s12. De senaste framstegen inom mikrofluidisk teknik har möjliggjort en ny generation enheter för snabb, encellig, mekanisk bedömning12,13. Dessa tekniker använder smala förträngningskanaler 14,15, skjuvflöde16 eller hydrodynamisk sträckning17 för att deformera celler snabbt vid genomströmningar av 10-1 000 celler / s18. Även om mäthastigheten för dessa metoder är betydligt snabbare än konventionella tekniker, handlar de ofta med hög genomströmningskapacitet för begränsade mekaniska avläsningar (tilläggstabell 1). Alla ovannämnda snabba mikrofluidiska metoder fokuserar på grundläggande mätvärden med en parameter, såsom transittid eller deformerbarhetsförhållanden, som endast återspeglar en cells elastiska egenskaper. Med tanke på den inneboende viskoelastiska naturen hos enskilda celler kräver emellertid en robust och grundlig mekanisk karakterisering av celler att man inte bara överväger elastiska komponenter utan också viskösa svar.

Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)2,8 (figur 1A) är en mikrofluidisk plattform som hanterar befintliga begränsningar med encells mekanofenotypning. Denna metod möjliggör mätning av flera biofysiska parametrar samtidigt, inklusive celldiameter, relativ deformerbarhet och återhämtningstid från deformation, med en måttlig genomströmning på 1-10 celler / s. Denna teknik är baserad på nod-poravkänning (NPS)19,20,21,22,23,24, vilket innebär att man använder en fyrpunktssondmätning för att mäta den modulerade strömpulsen som produceras av en cell som passerar en mikrofluidisk kanal som har segmenterats av bredare regioner, kallade “noder”. Den modulerade strömpulsen är ett resultat av att cellen delvis blockerar strömflödet i segmenten (dvs “porer”) och noder, med mer ström blockerad i den förra än i den senare. I mekano-NPS är ett segment, “sammandragningskanalen”, smalare än en celldiameter; Följaktligen måste en cell deformeras för att passera hela kanalen (figur 1B). Celldiametern kan bestämmas av storleken på den subpuls som produceras när cellen passerar nodporerna före sammandragningskanalen (figur 1B,C). Här, |ΔInp|, det aktuella fallet när cellen är i poren, är proportionellt mot cellens volymförhållande till poren, V-cellen / V-poren 2,8,19. Cellstyvhet kan bestämmas av ΔTc, varaktigheten av den dramatiskt större subpuls som produceras när cellen passerar sammandragningskanalen (figur 1B,C). En styvare cell tar längre tid att passera kanalen än en mjukare 2,8. Slutligen kan cellens “återhämtning”, cellens förmåga att återgå till sin ursprungliga storlek och form efter deformation, bestämmas av serien av subpulser som produceras när cellen passerar nodporerna efter sammandragningskanalen (figur 1B, C). Återhämtningstiden, ΔTr, är den tid det tar för de aktuella subpulserna att återgå till storleken på de tidigare subpulserna, innan cellen pressas. Sammantaget registreras och analyseras de modulerade strömpulser som produceras som en cell som passerar den mikrofluidiska kanalen för att extrahera de relevanta encelliga mekaniska parametrarna (figur 1D)2,8.

Reproducerbarheten och användarvänligheten av denna elektronikbaserade mikrofluidiska plattform har tidigare visats25. Dessutom presenterar plattformen en låg barriär för inträde för encells mekanofenotypning. Standard mjuk litografi används för att tillverka mikrofluidiska enheter. Mäthårdvaran består av billiga komponenter, inklusive ett enkelt kretskort (PCB), strömförsörjning, förförstärkare, datainsamlingskort (DAQ) och dator. Slutligen finns användarvänlig kod tillgänglig för datainsamling och analys, vilket möjliggör enkel implementering. Denna mekanofenotypningsteknik kan skilja populationer av icke-maligna och maligna bröst- och lungepitelcellinjer, skilja mellan underlinjer i primära humana bröstepitelceller och karakterisera effekterna av cytoskeletala störningar och andra farmakologiska medel 2,8. Sammantaget är denna plattform ett effektivt tillvägagångssätt för mekanofenotypning av enskilda celler.

Protocol

1. Designa enhetens geometri Välj bredden på storleks- och återhämtningssegmenten så att den är bredare än diametern på de största cellerna som ska mätas men också upprätthåller ett tillräckligt signal-brusförhållande (SNR). Se tilläggstabell 2 för exempel på olika storleks- och återvinningssegmentbredder för olika cellinjer. Välj kontraktionssegmentets bredd för att tillämpa en 30% -40% belastning på den genomsnittliga storleken på cellerna …

Representative Results

Den mekanofenotypningsplattform som presenteras här är ett enkelt och mångsidigt tillvägagångssätt för att mäta de biofysiska egenskaperna hos enskilda celler med måttlig genomströmning. Celler flödas genom den mikrofluidiska kanalen (figur 1A) med konstant tryckdrivet flöde. När cellerna passerar registreras längden på den mikrofluidiska kanalen och de producerade strömpulserna med hjälp av datainsamlingshårdvaran. Den förvärvade signalen (figur 1B,C…

Discussion

Mätning av de mekaniska egenskaperna hos enskilda celler med hjälp av denna mekanofenotypningsteknik består av tre steg: tillverkning av enheter, datainsamling och dataanalys. Inom varje steg finns det anmärkningsvärda aspekter som kan påverka de experimentella resultaten avsevärt. Under enhetstillverkningen är konsekventa kanalgeometrier och enhetlighet mellan enheter avgörande för exakta och repeterbara resultat. Mer specifikt bör sidoväggarna på varje enhet vara relativt släta (bild …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning stöddes av anslag från NIBIB 1R01EB024989-01 och NCI 1R01CA190843-01. A. L. och R. R. stöddes av ett H2H8 Association Graduate Research Fellowship. K. L. C. stöddes av ett National Science Foundation Graduate Research Fellowship och ett Siebel Scholar Fellowship.

Materials

Acetone J.T. Baker 5356-05 Purity (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminum Foil n/a n/a
Analog Low-Pass Filter ThorLabs EF504 ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsy Punch Integra Miltex 33-31AA-P/25 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Blade n/a n/a
BNC Cable Pomona Electronics 2249-C-12 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
medium=cpc&utm_campaign=
Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term=
&utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ
pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx
mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
w-EALw_wcB
Cleanroom Polyester Swab Thermo Fisher Scientific 18383 https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Current Preamplifier DL Instruments 1211 https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
Custom PCB (w/ components) n/a n/a see Supplemental files 4 and 5
DAQ Terminal Block National Instruments BNC-2120 https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ to BNC-2110 cable  National Instruments SHC68-68-EPM https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ) National Instruments PCI-6251 https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Dessicator Thermo Fisher Scientific 5311-0250 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Female BNC To Banana Plug Adapter Pomona Electronics 72909 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-186 https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glass Cutter Chemglass CG-1179-21 https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA Transene NC0977944 https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Hot Plate Thermo Fisher Scientific SP131825 
Isopropyl Alcohol Spectrum Chemical I1056-4LTPL Purity (GC)  ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metal Hardware Enclosure Hammond Manufacturing EJ12126 https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Purity (GC)  ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist DuPont n/a https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask Fineline Imaging n/a Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Microscope Slide Fisher Scientific 12-553-5B Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm 
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001 https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Plastic Petri Dish Thermo Fisher Scientific FB0875712 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Pressure Controller Fluigent MFCS-EZ https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Pressure Controller Software Fluigent MAESFLO
Programming & Computation Software MATLAB R2021b for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE Tubing Cole Parmer 06417-31 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter Millapore Sigma PHCC20060 https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer Wafer World 2885 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater n/a n/a
SU-8 3025 Negative Photoresist Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxane Dow Chemical 4019862 https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Tape Scotch 810-341296 https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titanium, Platinum, Gold n/a n/a
Triple Output Power Supply Keysight E36311A https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner Karl Suss America MJB3 Mask Aligner 

References

  1. Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038 (2017).
  2. Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mechano-node-pore sensing. Microsystems & Nanoengineering. 4, 17091 (2018).
  3. Mierke, C. T. Bidirectional mechanical response between cells and their microenvironment. Frontiers in Physics. 9, 619 (2021).
  4. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: The force journey of a tumor cell. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1), 113-127 (2009).
  5. Nia, H. T., Munn, L. L., Jain, R. K. Physical traits of cancer. Science. 370 (6516), (2020).
  6. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  7. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  8. Li, B., et al. Mechanical phenotyping reveals unique biomechanical responses in retinoic acid-resistant acute promyelocytic leukemia. iScience. 25 (2), 103772 (2022).
  9. Kozminsky, M., Sohn, L. L. The promise of single-cell mechanophenotyping for clinical applications. Biomicrofluidics. 14 (3), 031301 (2020).
  10. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  11. Wottawah, F., et al. Optical rheology of biological cells. Physical Review Letters. 94 (9), 1-4 (2005).
  12. Darling, E. M., Di Carlo, D. High-throughput assessment of cellular mechanical properties. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 35-62 (2015).
  13. Carey, T. R., Cotner, K. L., Li, B., Sohn, L. L. Developments in label-free microfluidic methods for single-cell analysis and sorting. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 11 (1), 1529 (2019).
  14. Bagnall, J. S., et al. Deformability of tumor cells versus blood cells. Scientific Reports. 5, 18542 (2015).
  15. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  16. Otto, O., et al. Real-time deformability cytometry: On-the-fly cell mechanical phenotyping. Nature Methods. 12 (3), 199-202 (2015).
  17. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  18. Guck, J., Chilvers, E. R. Mechanics meets medicine. Science Translational Medicine. 5 (212), 3-6 (2013).
  19. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: A robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab on a Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
  20. Carbonaro, A., Sohn, L. L. A resistive-pulse sensor chip for multianalyte immunoassays. Lab on a Chip. 5 (10), 1155-1160 (2005).
  21. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Direct detection of antibody-antigen binding using an on-chip artificial pore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (3), 820-824 (2003).
  22. Saleh, O. A., Sohn, L. L. An artificial nanopore for molecular sensing. Nano Letters. 3 (1), 37-38 (2003).
  23. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Quantitative sensing of nanoscale colloids using a microchip Coulter counter. Review of Scientific Instruments. 72 (12), 4449-4451 (2001).
  24. DeBlois, R. W., Bean, C. P. Counting and sizing of submicron particles by the resistive pulse technique. Review of Scientific Instruments. 41 (7), 909-916 (1970).
  25. Li, B., et al. Evaluating sources of technical variability in the mechano-node-pore sensing pipeline and their effect on the reproducibility of single-cell mechanical phenotyping. PLoS ONE. 16 (10), 0258982 (2021).
  26. Zhang, Z. M., Chen, S., Liang, Y. Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. Analyst. 135 (5), 1138-1146 (2010).
  27. Alibert, C., Goud, B., Manneville, J. B. Are cancer cells really softer than normal cells. Biology of the Cell. 109 (5), 167-189 (2017).
  28. Fujiwara, I., Zweifel, M. E., Courtemanche, N., Pollard, T. D. Latrunculin A accelerates actin filament depolymerization in addition to sequestering actin monomers. Current Biology. 28 (19), 3183-3192 (2018).
  29. Saleh, O. A. . A novel resistive pulse sensor for biological measurements. , (2003).
  30. Dokukin, M. E., Guz, N. V., Sokolov, I. Quantitative study of the elastic modulus of loosely attached cells in AFM indentation experiments. Biophysical Journal. 104 (10), 2123-2131 (2013).
  31. Li, Q., Lim, C. T., Goh, J. C. H., et al. Probing the elasticity of breast cancer cells using AFM. 13th International Conference on Biomedical Engineering. IFMBE Proceedings. 23, 2122-2125 (2009).
  32. Rother, J., et al. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Li, Q., et al. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (4), 609-613 (2008).
  34. Xu, C., et al. Elasticity measurement of breast cancer cells by atomic force microscopy. Proc. SPIE 9230. Twelfth International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine. (PIBM 2014). 92300, (2014).
  35. Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 84 (3), 2071-2079 (2003).
  36. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  37. Urbanska, M., et al. A comparison of microfluidic methods for high-throughput cell deformability measurements. Nature Methods. 17, 587-593 (2020).
  38. Hill, R. T., Chilkoti, A. Surface Patterning. Biomaterials Science: An Introduction to Materials: Third Edition. , 276-301 (2013).
  39. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. Journal of Applied Polymer Science. 131 (22), 41050 (2014).
  40. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  41. Stephens, A. D., Banigan, E. J., Adam, S. A., Goldman, R. D., Marko, J. F. Chromatin and lamin a determine two different mechanical response regimes of the cell nucleus. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1984-1996 (2017).
  42. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force microscopy of nonadherent cells: A comparison of leukemia cell deformability. Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  43. Evers, T. M. J., Holt, L. J., Alberti, S., Mashaghi, A. Reciprocal regulation of cellular mechanics and metabolism. Nature Metabolism. 3 (4), 456-468 (2021).
  44. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing enables label-free surface-marker profiling of single cells. Analytical Chemistry. 87 (5), 2988-2995 (2015).

Play Video

Citer Cet Article
Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L., Dong, A., Lustig, M., Sohn, L. L. Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements. J. Vis. Exp. (190), e64665, doi:10.3791/64665 (2022).

View Video