הכנת Facile ופוטואקטיבציה של ננו-מכלולים של Prodrug-Dye
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הייצור והאפיון של ננו-הרכבה של פרו-תרופות-צבע. המתודולוגיה לשחרור תרופות מהננו-חלקיקים על ידי פירוק המופעל על ידי אור, כולל מערך קרינת האור, מתוארת במפורש. התרופות ששוחררו מהננו-חלקיקים בעקבות הקרנת אור הפגינו השפעות מצוינות נגד התפשטות על תאי גידול במעי הגס האנושי.
Abstract
הרכבה עצמית היא שיטה פשוטה אך אמינה לבניית מערכות אספקת תרופות בקנה מידה ננומטרי. פרו-תרופות פוטואקטיבטיביות מאפשרות שחרור תרופות נשלט מננו-נשאים באתרי מטרה המווסתים על ידי קרינת אור. בפרוטוקול זה, מוצגת שיטה קלה לייצור ננו-חלקיקים פרו-תרופות-צבע הניתנים להפעלה באמצעות הרכבה עצמית מולקולרית. ההליכים לסינתזה של פרו-תרופות, ייצור ננו-חלקיקים, אפיון פיזיקלי של ננו-הרכבה, הדגמת פוטו-מחשוף ואימות ציטוטוקסיות חוץ גופית מתוארים בפירוט. תרופה הניתנת לצילום בורון-דיפירומתין-כלורמבוציל (BC) סונתזה לראשונה. BC וצבע אינפרא אדום קרוב, IR-783, ביחס אופטימלי, יכולים להרכיב את עצמם לננו-חלקיקים (IR783/BC NPs). הננו-חלקיקים המסונתזים היו בגודל ממוצע של 87.22 ננומטר ומטען פני השטח של -29.8 mV. הננו-חלקיקים התפרקו על ידי קרינת אור, אשר ניתן היה לצפות על ידי שידור מיקרוסקופיה אלקטרונית. הפוטוקלישוף של BC הושלם תוך 10 דקות, עם יעילות התאוששות של 22% עבור כלורמבוציל. הננו-חלקיקים הציגו ציטוטוקסיות משופרת תחת קרינת אור ב-530 ננומטר בהשוואה לננו-חלקיקים שלא הוקרנו ולפרו-תרופה BC חופשית שהוקרנה. פרוטוקול זה מספק התייחסות לבנייה והערכה של מערכות אספקת תרופות פוטורספונסיביות.
Introduction
כימותרפיה היא טיפול נפוץ בסרטן המשתמש בחומרים ציטוטוקסיים כדי להרוג תאים סרטניים ובכך מעכב את צמיחת הגידול1. עם זאת, חולים עלולים לסבול מתופעות לוואי כגון רעילות לב ו hepatotoxicity עקב ספיגה מחוץ למטרה של תרופות כימותרפיות 2,3,4. לכן, אספקת תרופות מקומית באמצעות בקרה מרחבית-זמנית של שחרור/הפעלת תרופות בגידולים חיונית כדי למזער את החשיפה לתרופות ברקמות נורמליות.
Prodrugs הן תרופות מהונדסות-כימית המציגות רעילות מופחתת ברקמות נורמליות תוך שמירה על פעולתן בנגעים חולים עם הפעלתן 5,6. פרו-תרופות יכולות להגיב למגוון גירויים, כגון pH7,8, אנזימים9,10, אולטרסאונד 11,12, חום 13 ואור14,15,1 6, ולשחרר את תרופות האב שלהם במיוחד בנגעים. אף על פי כן, פרו-תרופות רבות מציגות חסרונות מובנים, כגון מסיסות ירודה, קצב ספיגה שגוי והרס מטבולי מוקדם, מה שעלול להגביל את התפתחותן17. בהקשר זה, היווצרות ננו-מכלולים פרו-תרופתיים מציעה יתרונות כמו הפחתת תופעות לוואי, שחרור תרופות באתר, שימור טוב יותר והשילוב של טיפול והדמיה, מה שמצביע על פוטנציאל יישום גדול עבור ננו-מכלולים אלה. ננו-מכלולים פרו-תרופתיים רבים פותחו לטיפול במחלות, כולל ננו-ספירות פרו-תרופות דוקסורוביצין, מיצלות פרו-תרופות כורכומין וננו-סיבים פרו-תרופתי קמפטוטצין18.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה פשוטה להכנת ננו-מכלולים של צבע פרו-תרופתי המציגים תכולת פרו-תרופות גבוהה, פיזור מים טוב, יציבות לטווח ארוך ויכולת תגובה רגישה. IR783 הוא צבע מסיס במים קרוב לאינפרא אדום שיכול לשמש כמייצב של ננו-מכלולים19. המרכיב השני של הננו-הרכבה הוא בורון-דיפירומתן-כלורמבוציל (BODIPY-Cb, BC), פרו-תרופה שתוכננה משתי סיבות עיקריות. מכיוון שכלורמבוציל (Cb) מציג רעילות מערכתית in vivo, צורת הפרו-תרופה יכולה להפחית את רעילותו20. התרופה BC ניתנת לפוטוקליב באמצעות הקרנת אור של 530 ננומטר המכוונת לנגעי המחלה, מה שמאפשר שחרור מקומי של Cb. מצד שני, Cb נוטה להידרוליזה בסביבות מימיות, וניתן להגן עליו על ידי הפיכתו לטופס פרו-תרופתי21. לפיכך, ההרכבה המשותפת של פרו-תרופה BC וצבע IR-783 הייתה צפויה ליצור ננו-מערכת אספקת תרופות יציבה ויעילה (איור 1A). ננו-הרכבה זו של פרו-תרופות משפרת את הפיזור והיציבות של מולקולות הפרו-תרופה, מה שמרמז על הפוטנציאל שלה ליישום באספקת תרופות נשלטת אור. הפוטוקליף של התרופה BC מאפשר פירוק של ננו-חלקיקים ושחרור מבוקר אור של Cb בנגעים (איור משלים 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטת משקעים הבזק קלה לייצור ננו-חלקיקים בצבע פרו-תרופות, המציעה גישה פשוטה ונוחה ליצירת ננו-חלקיקים. ישנם מספר שלבים קריטיים בשיטה זו. ראשית, עבור כל שלבי הסינתזה, הייצור והאפיון, מיכלים כמו מיקרו-צינורות צריכים להיות מכוסים בנייר כסף כדי למנוע פיצול מיותר של התרופה BC על יד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בסיוע מאוניברסיטת הונג קונג Li Ka Shing Faculty of Medicine Faculty Core Facility. אנו מודים לפרופסור צ’י-מינג צ’ה מאוניברסיטת הונג קונג על אספקת קו התאים האנושי HCT116. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז מינג וואי לאו לרפואה מתקנת תוכנית חברים עמיתים ומועצת מענקי המחקר של הונג קונג (תוכנית קריירה מוקדמת, מס ‘27115220).
Materials
| 1260 Infinity II HPLC | Agilent Technologies | ||
| 2,4-Dimethyl pyrrole | J&K Scientific | 315305 | |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) | Gibco | M6494 | |
| 4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP) | J&K Scientific | 212279 | |
| 90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile | SPL | 11090 | |
| 96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile | SPL | 30096 | |
| Acetoxyacetyl chloride | J&K Scientific | 192001 | |
| Boron trifluoride diethyl etherate | J&K Scientific | 921076 | |
| Büchner funnel | AS ONE | 3-6466-01 | |
| Chlorambucil | J&K Scientific | 321407-1G | |
| CM100 Transmission Electron Microscope | Philips | ||
| CombiFlash RF chromatography system | Teledyne ISCO | ||
| Dichloromethane | DUKSAN Pure Chemicals | JT9315-88 | |
| Dimethyl sulfoxide | DUKSAN Pure Chemicals | 2762 | |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | DTS1070 | Zeta potential measurement |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| Empty Disposable Sample Load Cartridges | Teledyne ISCO | 693873225 | can hold up to 65 g |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | |
| Filtering flask | AS ONE | 3-7089-03 | |
| Hexane | DUKSAN Pure Chemicals | 4198 | |
| Holey carbon film on copper grid | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd | BZ10023a | |
| HPLC column (InfinityLab Poroshell 120) | Agilent Technologies | 695975-902T | |
| Integrating sphere photodiode power sensor | Thorlabs | S142C | |
| IR783 | Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd | I1031 | |
| LED | Mightex | LCS-0530-15-11 | |
| LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software) | Mightex | ||
| Lithium Hydroxide Anhydrous | TCI | L0225 | |
| Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether | Aladdin | M140783 | |
| N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA) | J&K Scientific | 203402 | |
| N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) | J&K Scientific | 275928 | |
| penicillin–streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (10×) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Power and energy meter | Thorlabs | PM100 USB | |
| Rotavapor | BUCHI Rotavapor R300 | ||
| RMPI 1640 | Gibco | 21870076 | |
| Separatory funnel (125 mL) | Synthware | F474125L | |
| Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g | Teledyne ISCO | 692203340 | |
| Sodium sulfate, anhydrous | Alfa Aesar | A19890 | |
| SpectraMax M4 | Molecular Devices LLC | ||
| Tetrahydrofuran (THF), anhydrous | J&K Scientific | 943616 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Vortex | DLAB Scientific Co., Ltd | MX-S | |
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instrument |
References
- Chabner, B. A., Roberts, T. G. Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
- Monsuez, J. -. J., Charniot, J. -. C., Vignat, N., Artigou, J. -. Y. Cardiac side-effects of cancer chemotherapy. International Journal of Cardiology. 144 (1), 3-15 (2010).
- Floyd, J., Mirza, I., Sachs, B., Perry, M. C. Hepatotoxicity of chemotherapy. Seminars in Oncology. 33 (1), 50-67 (2006).
- Bar-Joseph, H., Stemmer, S. M., Tsarfaty, I., Shalgi, R., Ben-Aharon, I. Chemotherapy-induced vascular toxicity-real-time in vivo imaging of vessel impairment. Journal of Visualized Experiments. (95), e51650 (2015).
- Denny, W. A. Prodrug strategies in cancer therapy. European Journal of Medicinal Chemistry. 36 (7-8), 577-595 (2001).
- Kastrati, I., Delgado-Rivera, L., Georgieva, G., Thatcher, G. R. J., Frasor, J. Synthesis and characterization of an aspirin-fumarate prodrug that inhibits NFκB activity and breast cancer stem cells. Journal of Visualized Experiments. (119), e54798 (2017).
- Mao, J., et al. A simple dual-pH responsive prodrug-based polymeric micelles for drug delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (27), 17109-17117 (2016).
- Li, S. -. Y., et al. A pH-responsive prodrug for real-time drug release monitoring and targeted cancer therapy. Chemical Communications. 50 (80), 11852-11855 (2014).
- Andresen, T. L., Thompson, D. H., Kaasgaard, T. Enzyme-triggered nanomedicine: Drug release strategies in cancer therapy (Invited Review). Molecular Membrane Biology. 27 (7), 353-363 (2010).
- Xu, G., McLeod, H. L. Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy. Clinical Cancer Research. 7 (11), 3314-3324 (2001).
- Luo, W., et al. Dual-targeted and pH-sensitive doxorubicin prodrug-microbubble complex with ultrasound for tumor treatment. Theranostics. 7 (2), 452 (2017).
- Gao, J., et al. Ultrasound triggered phase-change nanodroplets for doxorubicin prodrug delivery and ultrasound diagnosis: An in vitro study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 174, 416-425 (2019).
- Brade, A. M., Szmitko, P., Ngo, D., Liu, F. -. F., Klamut, H. J. Heat-directed suicide gene therapy for breast cancer. Cancer Gene Therapy. 10 (4), 294-301 (2003).
- Long, K., et al. One-photon red light-triggered disassembly of small-molecule nanoparticles for drug delivery. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 357 (2021).
- Liu, Y., Long, K., Kang, W., Wang, T., Wang, W. Optochemical control of immune checkpoint blockade via light-triggered PD-L1 dimerization. Advanced NanoBiomed Research. 2 (6), 2200017 (2022).
- Wang, T., et al. Optochemical control of mTOR signaling and mTOR-dependent autophagy. ACS Pharmacology & Translational Science. 5 (3), 149-155 (2022).
- Abet, V., Filace, F., Recio, J., Alvarez-Builla, J., Burgos, C. Prodrug approach: An overview of recent cases. European Journal of Medicinal Chemistry. 127, 810-827 (2017).
- Li, G., et al. Small-molecule prodrug nanoassemblies: an emerging nanoplatform for anticancer drug delivery. Small. 17 (52), 2101460 (2021).
- Shamay, Y., et al. Quantitative self-assembly prediction yields targeted nanomedicines. Nature Materials. 17 (4), 361-368 (2018).
- Sinoway, P. A., Callen, J. P. Chlorambucil. Arthritis & Rheumatism. 36 (3), 319-324 (1993).
- Owen, W. R., Stewart, P. J. Kinetics and mechanism of chlorambucil hydrolysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 68 (8), 992-996 (1979).
- Lv, W., et al. Upconversion-like photolysis of BODIPY-based prodrugs via a one-photon process. Journal of the American Chemical Society. 141 (44), 17482-17486 (2019).
- Silver, J. Let us teach proper thin layer chromatography technique. Journal of Chemical Education. 97 (12), 4217-4219 (2020).
- Saad, W. S., Prud’homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
- Long, K., et al. Photoresponsive prodrug-dye nanoassembly for in-situ monitorable cancer therapy. Bioengineering & Translational Medicine. 7 (3), 10311 (2022).
- Zhong, T., et al. A self-assembling nanomedicine of conjugated linoleic acid-paclitaxel conjugate (CLA-PTX) with higher drug loading and carrier-free characteristic. Scientific Reports. 6 (1), 36614 (2016).
- Long, K., et al. Green light-triggered intraocular drug release for intravenous chemotherapy of retinoblastoma. Advanced Science. 8 (20), 2101754 (2021).
- Lv, W., Wang, W. One-photon upconversion-like photolysis: a new strategy to achieve long-wavelength light-excitable photolysis. Synlett. 31 (12), 1129-1134 (2020).
- Rwei, A. Y., Wang, W., Kohane, D. S. Photoresponsive nanoparticles for drug delivery. Nano Today. 10 (4), 451-467 (2015).
- Grzelczak, M., Vermant, J., Furst, E. M., Liz-Marzán, L. M. Directed self-assembly of nanoparticles. ACS Nano. 4 (7), 3591-3605 (2010).
- Gnanasammandhan, M. K., Idris, N. M., Bansal, A., Huang, K., Zhang, Y. Near-IR photoactivation using mesoporous silica-coated NaYF4:Yb,Er/Tm upconversion nanoparticles. Nature Protocols. 11 (4), 688-713 (2016).
