Il sistema Zebrafish Tol2: un approccio di transgenesi modulare e flessibile basato su gateway
Summary
Questo lavoro descrive un protocollo per il sistema modulare di transgenesi Tol2, un metodo di clonazione basato su gateway per creare e iniettare costrutti transgenici in embrioni di zebrafish.
Abstract
I disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD) sono caratterizzati da un insieme altamente variabile di difetti strutturali e disturbi cognitivi che insorgono a causa dell’esposizione prenatale all’etanolo. A causa della complessa patologia della FASD, i modelli animali si sono dimostrati fondamentali per la nostra attuale comprensione dei difetti di sviluppo indotti dall’etanolo. I pesci zebra hanno dimostrato di essere un potente modello per esaminare i difetti di sviluppo indotti dall’etanolo a causa dell’alto grado di conservazione sia della genetica che dello sviluppo tra zebrafish e umani. Come sistema modello, i pesci zebra possiedono molti attributi che li rendono ideali per gli studi sullo sviluppo, tra cui un gran numero di embrioni fecondati esternamente che sono geneticamente trattabili e traslucidi. Ciò consente ai ricercatori di controllare con precisione i tempi e il dosaggio dell’esposizione all’etanolo in più contesti genetici. Un importante strumento genetico disponibile nel pesce zebra è la transgenesi. Tuttavia, generare costrutti transgenici e stabilire linee transgeniche può essere complesso e difficile. Per affrontare questo problema, i ricercatori del pesce zebra hanno stabilito il sistema di transgenesi Tol2 basato su trasposoni. Questo sistema modulare utilizza un approccio di clonazione gateway multisito per l’assemblaggio rapido di costrutti transgenici completi basati su trasposoni Tol2. Qui, descriviamo la cassetta degli attrezzi flessibile del sistema Tol2 e un protocollo per generare costrutti transgenici pronti per la transgenesi del pesce zebra e il loro uso negli studi sull’etanolo.
Introduction
L’esposizione prenatale all’etanolo dà origine a un continuum di deficit strutturali e disturbi cognitivi definiti disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD)1,2,3,4. Le complesse relazioni tra molteplici fattori rendono difficile lo studio e la comprensione dell’eziologia della FASD negli esseri umani. Per risolvere questa sfida, è stata utilizzata un’ampia varietà di modelli animali. Gli strumenti biologici e sperimentali disponibili in questi modelli si sono dimostrati cruciali nello sviluppo della nostra comprensione delle basi meccanicistiche della teratogenicità dell’etanolo e i risultati di questi sistemi modello sono stati notevolmente coerenti con ciò che si trova negli studi sull’etanolo umano 5,6. Tra questi, i pesci zebra sono emersi come un potente modello per studiare la teratogenesi dell’etanolo7,8, in parte a causa della loro fecondazione esterna, alta fecondità, trattabilità genetica ed embrioni traslucidi. Questi punti di forza si combinano per rendere il pesce zebra ideale per studi di imaging live in tempo reale di FASD utilizzando linee di zebrafish transgeniche.
I pesci zebra transgenici sono stati ampiamente utilizzati per studiare molteplici aspetti dello sviluppo embrionale9. Tuttavia, la creazione di costrutti transgenici e successive linee transgeniche può essere estremamente difficile. Un transgene standard richiede un elemento promotore attivo per guidare il transgene e un segnale o “coda” poli A, il tutto in un vettore batterico stabile per il mantenimento generale del vettore. La generazione tradizionale di un costrutto transgenico multicomponente richiede più fasi di sub-clonazione che richiedono molto tempo10. Gli approcci basati sulla PCR, come l’assemblaggio Gibson, possono aggirare alcuni dei problemi associati alla subclonazione. Tuttavia, primer unici devono essere progettati e testati per la generazione di ogni costrutto transgenico unico10. Oltre alla costruzione del transgene, anche l’integrazione genomica, la trasmissione della linea germinale e lo screening per una corretta integrazione transgenica sono stati difficili. Qui, descriviamo un protocollo per l’utilizzo del sistema di transgenesi Tol2 basato su trasposone (Tol2Kit)10,11. Questo sistema modulare utilizza la clonazione multisito di gateway per generare rapidamente più costrutti transgenici da una libreria in continua espansione di vettori “ingresso” e “destinazione”. Gli elementi trasponibili Tol2 integrati aumentano notevolmente il tasso di transgenesi, consentendo la rapida costruzione e integrazione genomica di più transgeni. Utilizzando questo sistema, mostriamo come la generazione di una linea di zebrafish transgenico endoderma può essere utilizzata per studiare i difetti strutturali tessuto-specifici alla base della FASD. In definitiva, in questo protocollo, dimostriamo che la configurazione modulare e la costruzione di costrutti transgenici aiuteranno notevolmente la ricerca FASD basata sul pesce zebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
I pesci zebra sono ideali per studiare l’impatto dell’esposizione all’etanolo sullo sviluppo e sugli stati patologici 7,8. I pesci zebra producono un gran numero di embrioni traslucidi, fecondati esternamente e geneticamente trattabili, che consentono l’imaging dal vivo di diversi tessuti e tipi di cellule marcati con transgene contemporaneamente in più contesti ambientali19,20. Questi punti di forza, co…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca presentata in questo articolo è stata supportata da una sovvenzione del National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 a CBL.
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
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