תרבית ארוכת טווח וניטור של Caenorhabditis elegans מבודדים על מדיה מוצקה במכשירים מרובי בארות
Summary
מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לגידול נמטודות בודדות מבודדות על מדיה מוצקה בהתקנים מרובי בארות מיקרו-מפוברקים. גישה זו מאפשרת לעקוב אחר בעלי חיים בודדים לאורך חייהם עבור מגוון פנוטיפים הקשורים להזדקנות ולבריאות, כולל פעילות, גודל וצורת גוף, גיאומטריה של תנועה והישרדות.
Abstract
הנמטודה Caenorhabditis elegans היא בין מערכות המודל הנפוצות ביותר המשמשות במחקר ההזדקנות בשל טכניקות התרבית הפשוטות והזולות שלה, מחזור רבייה מהיר (~ 3 ימים), תוחלת חיים קצרה (~ 3 שבועות), וכלים זמינים רבים למניפולציה גנטית וניתוח מולקולרי. הגישה הנפוצה ביותר לביצוע מחקרי הזדקנות ב- C. elegans, כולל ניתוח הישרדות, כוללת גידול אוכלוסיות של עשרות עד מאות בעלי חיים יחד על מצע גידול נמטודות מוצקות (NGM) בלוחות פטרי. בעוד גישה זו אוספת נתונים על אוכלוסיית בעלי חיים, רוב הפרוטוקולים אינם עוקבים אחר בעלי חיים בודדים לאורך זמן. מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לגידול ארוך טווח של בעלי חיים בודדים על מכשירי פולידימתילסילוקסאן (PDMS) מיקרו-מפוברקים הנקראים WorMotels. כל מכשיר מאפשר לגדל עד 240 בעלי חיים בבארות קטנות המכילות גז טבעי טבעי, כאשר כל באר מבודדת על ידי חפיר המכיל נחושת גופרתית המונע מבעלי החיים לברוח. בהתבסס על התיאור המקורי של WorMotel, מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לעיצוב, הכנה ואכלוס של כל מכשיר, עם תיאורים של סיבוכים טכניים נפוצים ועצות לפתרון בעיות. פרוטוקול זה כולל טכניקות לטעינה עקבית של גז טבעי בנפח קטן, ייבוש עקבי הן של גז טבעי טבעי והן של מזון חיידקי, אפשרויות למתן התערבויות פרמקולוגיות, הוראות ומגבלות מעשיות לשימוש חוזר במכשירי PDMS, וטיפים למזעור התייבשות, אפילו בסביבות עם לחות נמוכה. טכניקה זו מאפשרת ניטור אורכי של פרמטרים פיזיולוגיים שונים, כולל פעילות מגורה, פעילות לא מגורה, גודל גוף, גיאומטריה תנועתית, תוחלת בריאות והישרדות, בסביבה דומה לטכניקה הסטנדרטית לתרבות קבוצתית על מדיה מוצקה בלוחות פטרי. שיטה זו תואמת לאיסוף נתונים בתפוקה גבוהה כאשר משתמשים בה בשילוב עם תוכנת מיקרוסקופיה וניתוח אוטומטית. לבסוף, נדונות מגבלותיה של טכניקה זו, כמו גם השוואה של גישה זו לשיטה שפותחה לאחרונה המשתמשת במיקרו-מגשים לתרבית נמטודות מבודדות על מדיה מוצקה.
Introduction
Caenorhabditis elegans נפוצים במחקרי הזדקנות בגלל זמן הדור הקצר שלהם (כ -3 ימים), תוחלת חיים קצרה (כ -3 שבועות), קלות הגידול במעבדה, רמה גבוהה של שימור אבולוציוני של תהליכים מולקולריים ומסלולים עם יונקים, וזמינות רחבה של טכניקות מניפולציה גנטית. בהקשר של מחקרי הזדקנות, C. elegans מאפשרים יצירה מהירה של נתוני אריכות ימים ואוכלוסיות מבוגרות לניתוח פנוטיפים מאוחרים בבעלי חיים חיים. הגישה הטיפוסית לביצוע מחקרי הזדקנות תולעים כוללת מדידה ידנית של תוחלת החיים של אוכלוסיית תולעים המתוחזקת בקבוצות של 20 עד 70 בעלי חיים על מצע גידול נמטודות אגר מוצק (NGM) בלוחות פטרי בגודל 6 ס”מ1. שימוש באוכלוסיות מסונכרנות גיל מאפשר מדידה של תוחלת חיים או פנוטיפים חתך בבעלי חיים בודדים על פני האוכלוסייה, אך שיטה זו מונעת ניטור המאפיינים של בעלי חיים בודדים לאורך זמן. גישה זו היא גם עתירת עבודה, ובכך מגבילה את גודל האוכלוסייה שניתן לבדוק.
ישנן מספר מצומצם של שיטות תרבית המאפשרות ניטור אורכי של C. elegans בודדים לאורך כל חייהם, ולכל אחד מהם יש מערכת ייחודית של יתרונות וחסרונות. מכשירי מיקרופלואידיקה, כולל WormFarm2, NemaLife3 ושבב “התנהגות”4, בין היתר 5,6,7, מאפשרים ניטור של בעלי חיים בודדים לאורך זמן. גידול תולעים בתרבית נוזלית באמצעות לוחות מרובי בארות מאפשר באופן דומה ניטור של בעלי חיים בודדים או אוכלוסיות קטנות של C. elegans לאורך זמן 8,9. הסביבה הנוזלית מייצגת הקשר סביבתי שונה מסביבת התרבית הנפוצה על מצע מוצק בצלחות פטרי, אשר יכול לשנות היבטים בפיזיולוגיה של בעלי חיים הרלוונטיים להזדקנות, כולל תכולת שומן וביטוי גנים של תגובת דחק10,11. היכולת להשוות ישירות מחקרים אלה לרוב הנתונים שנאספו על הזדקנות C. elegans מוגבלת על ידי הבדלים במשתנים סביבתיים חשובים פוטנציאליים. Worm Corral12 היא גישה אחת שפותחה כדי לשכן בעלי חיים בודדים בסביבה שמשכפלת באופן הדוק יותר תרבות מדיה מוצקה טיפוסית. קורל התולעת מכיל תא אטום לכל בעל חיים במגלשת מיקרוסקופ באמצעות הידרוג’ל, המאפשר ניטור אורכי של בעלי חיים מבודדים. שיטה זו משתמשת בדימות שדה בהיר סטנדרטי כדי להקליט נתונים מורפולוגיים, כגון גודל גוף ופעילות. עם זאת, בעלי חיים ממוקמים בסביבת הידרוג’ל כעוברים, שם הם נשארים ללא הפרעה לאורך כל חייהם. זה דורש שימוש ברקע גנטי מוטנטי או טרנסגני סטרילי מותנה, מה שמגביל הן את היכולת לבדיקות גנטיות, שכן כל מוטציה או טרנסגן חדש צריך לעבור לרקע עם עקרות מותנית, והן את היכולת לבדיקת תרופות, שכן טיפולים יכולים להיות מיושמים רק פעם אחת על בעלי החיים כעוברים.
שיטה חלופית שפותחה על ידי מעבדת פאנג-ין מאפשרת גידול תולעים על מדיה מוצקה בבארות בודדות של מכשיר פולידימתילסילוקסאן (PDMS) מיקרו-מפוברק הנקרא WorMotel13,14. כל מכשיר ממוקם בתוך מגש באר אחת (כלומר, עם אותם ממדים כמו צלחת 96 בארות) ויש לו 240 בארות המופרדות על ידי חפיר מלא בתמיסה מרתיעה כדי למנוע את התולעים מלעבור בין בארות. כל באר יכולה לאכלס תולעת בודדת למשך תוחלת החיים שלה. המכשיר מוקף בכדורי ג’ל פוליאקרילאמיד סופגי מים (המכונים “גבישי מים”), והמגש אטום בסרט מעבדה Parafilm כדי לשמור על הלחות ולמזער את התייבשות המדיה. מערכת זו מאפשרת לאסוף נתוני תוחלת חיים ותוחלת חיים עבור בעלי חיים בודדים, בעוד שהשימוש במדיה מוצקה משחזר טוב יותר את הסביבה שחוו בעלי חיים ברוב המכריע של מחקרי תוחלת החיים של C. elegans שפורסמו, ובכך מאפשר השוואה ישירה יותר. לאחרונה פותחה טכניקה דומה באמצעות מיקרו-מגשים מפוליסטירן ששימשו במקור לבדיקות מיקרוציטוטוקסיות15 במקום מכשיר PDMS16. שיטת המיקרו-מגש מאפשרת איסוף נתונים פרטניים עבור תולעים שגודלו בתרבית על מצע מוצק ויש לה יכולת משופרת להכיל תולעים בתנאים שבדרך כלל יגרמו לבריחה (למשל, גורמי עקה או הגבלה תזונתית), כאשר התמורה היא שכל מיקרו-מגש יכול להכיל רק 96 בעלי חיים16, בעוד שהמכשיר הרב-באר המשמש כאן יכול להכיל עד 240 בעלי חיים.
מוצג כאן פרוטוקול מפורט להכנת התקנים מרובי בארות המותאם לעקביות צלחת לצלחת והכנת מכשירים מרובים במקביל. פרוטוקול זה הותאם מהפרוטוקול המקורי ממעבדת פאנג-ין13. באופן ספציפי, ישנם תיאורים לטכניקות כדי למזער זיהום, לייעל את הייבוש העקבי הן של המדיה המוצקה והן של מקור המזון החיידקי, ולספק RNAi ותרופות. מערכת זו יכולה לשמש למעקב אחר תוחלת הבריאות האישית, תוחלת החיים ופנוטיפים אחרים, כגון גודל הגוף וצורתו. התקנים מרובי בארות אלה תואמים למערכות קיימות בעלות תפוקה גבוהה למדידת תוחלת חיים, אשר יכולות להסיר חלק ניכר מהעבודה הידנית הכרוכה בניסויים מסורתיים בתוחלת חיים ולספק הזדמנות למדידה אוטומטית וישירה של אריכות ימים ומעקב בריאות ב- C. elegans בודדים בקנה מידה גדול.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת WorMotel היא כלי רב עוצמה לאיסוף נתונים אישיים עבור מאות C. elegans מבודדים לאורך זמן. בעקבות המחקרים הקודמים שהשתמשו במכשירים מרובי בארות ליישומים בשקט התפתחותי, התנהגות מוטורית והזדקנות, מטרת עבודה זו הייתה לייעל את ההכנה של מכשירים מרובי בארות לניטור ארוך טווח של פעילות, בריאות ותוח…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R35GM133588 ל- G.L.S., פרס Catalyst של האקדמיה הלאומית לרפואה של ארצות הברית ל- G.L.S., קרן יוזמת הטכנולוגיה והמחקר של מדינת אריזונה המנוהלת על ידי מועצת העוצרים של אריזונה, והקרן הרפואית אליסון.
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
References
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
- Çelen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
- Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
- Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Freitas, S. Worm Paparazzi – A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , (2021).
- Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
- Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
- Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
- Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
- McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
- Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
- Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
- Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
