Многолетнее культивирование и мониторинг изолированных Caenorhabditis elegans на твердых средах в многолуночных устройствах
Summary
Представлен оптимизированный протокол культивирования изолированных отдельных нематод на твердых средах в микрофабрикованных многолуночных устройствах. Этот подход позволяет контролировать отдельных животных на протяжении всей их жизни на предмет различных фенотипов, связанных со старением и здоровьем, включая активность, размер и форму тела, геометрию движения и выживание.
Abstract
Нематода Caenorhabditis elegans является одной из наиболее распространенных модельных систем, используемых в исследованиях старения, благодаря своим простым и недорогим методам культивирования, быстрому циклу размножения (~ 3 дня), короткой продолжительности жизни (~ 3 недели) и многочисленным доступным инструментам для генетических манипуляций и молекулярного анализа. Наиболее распространенный подход к проведению исследований старения у C. elegans, включая анализ выживаемости, включает культивирование популяций от десятков до сотен животных вместе на твердых средах роста нематод (NGM) в планшетах Петри. Хотя этот подход собирает данные о популяции животных, большинство протоколов не отслеживают отдельных животных с течением времени. Здесь представлен оптимизированный протокол для долгосрочного культивирования отдельных животных на микрофабрикованных устройствах из полидиметилсилоксана (PDMS), называемых WorMotels. Каждое устройство позволяет культивировать до 240 животных в небольших лунках, содержащих NGM, при этом каждая лунка изолирована рвом, содержащим сульфат меди, который предотвращает бегство животных. Основываясь на оригинальном описании WorMotel, в этом документе представлен подробный протокол формования, подготовки и заполнения каждого устройства с описанием общих технических сложностей и советами по устранению неполадок. В рамках этого протокола представлены методы последовательной загрузки NGM небольшого объема, последовательная сушка как NGM, так и бактериальной пищи, варианты проведения фармакологических вмешательств, инструкции и практические ограничения для повторного использования устройств PDMS, а также советы по минимизации высыхания даже в условиях низкой влажности. Этот метод позволяет проводить продольный мониторинг различных физиологических параметров, включая стимулированную активность, нестимулированную активность, размер тела, геометрию движения, продолжительность жизни и выживаемость, в среде, аналогичной стандартной методике группового культивирования на твердых средах в планшетах Петри. Этот метод совместим с высокопроизводительным сбором данных при использовании в сочетании с программным обеспечением для автоматической микроскопии и анализа. Наконец, обсуждаются ограничения этого метода, а также сравнение этого подхода с недавно разработанным методом, который использует микролотки для культивирования изолированных нематод на твердых средах.
Introduction
Caenorhabditis elegans обычно используются в исследованиях старения из-за их короткого времени генерации (примерно 3 дня), короткой продолжительности жизни (около 3 недель), простоты культивирования в лаборатории, высокой степени эволюционного сохранения молекулярных процессов и путей с млекопитающими, а также широкой доступности методов генетических манипуляций. В контексте исследований старения C. elegans позволяет быстро генерировать данные о долголетии и возрастных популяциях для анализа фенотипов позднего возраста у живых животных. Типичный подход к проведению исследований старения червей включает ручное измерение продолжительности жизни популяции червей, содержащихся в группах от 20 до 70 животных на твердой питательной среде агаровой нематоды (NGM) в 6-сантиметровых пластинах Петри1. Использование популяций, синхронизированных по возрасту, позволяет измерять продолжительность жизни или фенотипы поперечного сечения у отдельных животных в популяции, но этот метод исключает мониторинг характеристик отдельных животных с течением времени. Этот подход также является трудоемким, что ограничивает размер популяции, которая может быть протестирована.
Существует ограниченное количество методов культивирования, которые позволяют проводить продольный мониторинг отдельных C. elegans на протяжении всей их жизни, и каждый из них имеет определенный набор преимуществ и недостатков. Устройства микрофлюидики, в том числе WormFarm2, NemaLife3 и чип «поведения»4, среди прочих 5,6,7, позволяют контролировать отдельных животных с течением времени. Культивирование червей в жидкой культуре с использованием многолуночных планшетов аналогичным образом позволяет контролировать как отдельных животных, так и небольшие популяции C. elegans с течением времени 8,9. Жидкая среда представляет собой особый экологический контекст от обычной культурной среды на твердых средах в пластинах Петри, что может изменять аспекты физиологии животных, имеющие отношение к старению, включая содержание жира и экспрессию генов реакции на стресс10,11. Возможность прямого сравнения этих исследований с большинством данных, собранных о старении C. elegans, ограничена различиями в потенциально важных переменных окружающей среды. Worm Corral12 — это один из подходов, разработанный для размещения отдельных животных в среде, которая более точно воспроизводит типичную культуру твердых сред. Загон для червей содержит герметичную камеру для каждого животного на предметном стекле микроскопа с использованием гидрогеля, что позволяет проводить продольный мониторинг изолированных животных. Этот метод использует стандартную визуализацию светлого поля для записи морфологических данных, таких как размер тела и активность. Тем не менее, животные помещаются в гидрогелевую среду в качестве эмбрионов, где они остаются нетронутыми на протяжении всей своей жизни. Это требует использования условно стерильных мутантных или трансгенных генетических фонов, что ограничивает как возможности для генетического скрининга, поскольку каждая новая мутация или трансген должны быть скрещены на фоне с условной стерильностью, так и способность к скринингу лекарств, поскольку лечение может быть применено только один раз к животным в качестве эмбрионов.
Альтернативный метод, разработанный лабораторией Fang-Yen, позволяет культивировать червей на твердых средах в отдельных лунках микрофабрикованного устройства из полидиметилсилоксана (PDMS) под названием WorMotel13,14. Каждое устройство помещается в однолуночный лоток (т.е. с теми же размерами, что и 96-луночная пластина) и имеет 240 лунок, разделенных рвом, заполненным аверсивным раствором, чтобы предотвратить перемещение червей между лунками. В каждой скважине может находиться один червь в течение всей его жизни. Устройство окружено водопоглощающими гранулами полиакриламидного геля (называемыми «кристаллами воды»), а лоток запечатан лабораторной пленкой Parafilm для поддержания влажности и минимизации высыхания среды. Эта система позволяет собирать данные о продолжительности жизни и продолжительности жизни отдельных животных, в то время как использование твердых сред лучше повторяет окружающую среду, в которой обитают животные в подавляющем большинстве опубликованных исследований продолжительности жизни C. elegans, что позволяет проводить более прямые сравнения. Недавно аналогичная методика была разработана с использованием полистирольных микролотков, которые первоначально использовались для анализов микроцитотоксичности15 вместо устройства16 PDMS. Метод микролотка позволяет собирать индивидуализированные данные о червях, культивируемых на твердых средах, и обладает улучшенной способностью удерживать червей в условиях, которые обычно вызывают бегство (например, стрессоры или диетические ограничения), при этом компромисс заключается в том, что каждый микролоток может содержать только 96 животных16, тогда как используемое здесь многолуночное устройство может содержать до 240 животных.
Здесь представлен подробный протокол подготовки многолуночных устройств, оптимизированный для согласованности между пластинами и параллельной подготовки нескольких устройств. Этот протокол был адаптирован из оригинального протокола из лаборатории Fang-Yen13. В частности, описаны методы минимизации загрязнения, оптимизации последовательной сушки как твердой среды, так и бактериального источника пищи, а также доставки РНК-интерференции и лекарств. Эта система может использоваться для отслеживания индивидуальной продолжительности здоровья, продолжительности жизни и других фенотипов, таких как размер и форма тела. Эти многолуночные устройства совместимы с существующими высокопроизводительными системами для измерения продолжительности жизни, что может устранить большую часть ручного труда, связанного с традиционными экспериментами по продолжительности жизни, и предоставить возможность автоматизированного прямого измерения продолжительности жизни и отслеживания здоровья у отдельных C. elegans в масштабе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Система WorMotel является мощным инструментом для сбора индивидуализированных данных о сотнях изолированных C. elegans с течением времени. Вслед за более ранними исследованиями с использованием многолуночных устройств для применения в состоянии покоя в развитии, опорно-двигательном по?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH R35GM133588 для G.L.S., премией Национальной академии медицины США за катализатор для G.L.S., Фондом технологической и исследовательской инициативы штата Аризона, управляемым Советом регентов Аризоны, и Медицинским фондом Эллисона.
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
References
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
- Çelen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
- Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
- Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Freitas, S. Worm Paparazzi – A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , (2021).
- Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
- Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
- Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
- Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
- McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
- Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
- Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
- Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
