Uzunlamasına floresan izleme ve aversif müdahaleler için katı ortam üzerinde bireysel caenorhabditis elegans'ın uzun süreli kültürü
Summary
Burada, yaşam boyu fizyolojik parametre takibi ve floresan ölçümü için katı ortam üzerinde izole edilmiş bireysel nematodların kültürlenmesine yönelik bir protokol sunuyoruz. Bu kültür sistemi, hayvanların kaçmasını önlemek için tek solucan kuyularının etrafında bir palmitik asit bariyeri içerir ve patojenik bakteriler ve kimyasal stresörler de dahil olmak üzere önleyici müdahalelerin kullanılmasına izin verir.
Abstract
Caenorhabditis elegans yaşlanma biyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. C. elegans yaşlanma çalışmalarındaki standart uygulama, solucan gruplarının katı nematod büyüme ortamı (NGM) üzerinde kültürlenmesi, hayatta kalma ve diğer fizyolojik fenotipler için popülasyon düzeyinde verilerin verimli bir şekilde toplanmasına ve floresan biyobelirteç niceliği için alt popülasyonların periyodik olarak örneklenmesine izin vermektir. Bu yaklaşımın sınırlamaları, (1) ilgilenilen fenotipler için yaş yörüngeleri geliştirmek üzere zaman içinde bireysel solucanları takip edememe ve (2) floresan biyobelirteçleri doğrudan kültür ortamı bağlamında izleyememedir. Alternatif kültür yaklaşımları, bireysel hayvanları zaman içinde izlemek için sıvı kültür veya mikroakışkanlar kullanır, bazı durumlarda floresan niceliği de dahil olmak üzere, kültür ortamının katı NGM’den bağlamsal olarak farklı olduğu ödünleşimi ile. WorMotel, katı NGM üzerinde izole solucanların kültürlenmesi için daha önce tarif edilmiş mikrofabrikasyon çok kuyucuklu bir cihazdır. Her solucan, C. elegans için bir temas kovucu olan bakır sülfatla doldurulmuş bir hendekle çevrili katı NGM içeren bir kuyuda tutulur ve bireysel hayvanların uzunlamasına izlenmesini sağlar. Bakır sülfatın, diyet kısıtlaması, patojenik bakteriler ve hücresel strese neden olan kimyasal ajanlar da dahil olmak üzere yaşlanma araştırmalarında yaygın olan engelleyici müdahalelere maruz kaldıklarında solucanların kaçmasını önlemek için yetersiz buluyoruz. Çok kuyucuklu cihazlar ayrıca floresan görüntülemede yüksek arka plan artefaktları üreten polidimetilsiloksandan kalıplanmıştır. Bu protokol, orijinal olarak insan lökosit antijeni (HLA) tiplemesi için tasarlanmış, yaşam süresi boyunca hayatta kalma, fizyolojik fenotipler ve floresan ölçümüne izin veren, ticari olarak temin edilebilen polistiren mikrotrayları kullanarak katı NGM üzerinde izole yuvarlak kurtların kültürlenmesi için yeni bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bir palmitik asit bariyeri, engelleyici koşulların varlığında bile solucanların kaçmasını önler. Her plaka 96 hayvana kadar kültür yapabilir ve diyet kısıtlaması, RNAi ve kimyasal katkı maddeleri dahil olmak üzere çeşitli koşullara kolayca adapte olur ve kullanım ömrü ve aktivite verilerini toplamak için otomatik sistemlerle uyumludur.
Introduction
C. elegans, genetik, hücresel biyoloji ve moleküler biyoloji araştırmaları için güçlü bir model organizmadır, çünkü laboratuvarda kolayca kültürlenirler, kısa bir üretim süresine ve ömrüne sahiptirler, memelilerle yüksek derecede protein homolojisini paylaşırlar ve floresan proteinlerin ve boyaların in vivo görselleştirilmesine izin veren şeffaf bir vücut yapısına sahiptirler1. C. elegans’ın gelişim biyolojisi ve yaşlanma da dahil olmak üzere bir dizi alanda büyük bir model sistem olarak uzun süredir kullanılmasının bir sonucu olarak, büyüme ve gelişmeleri iyi anlaşılmış, genomları tamamen sıralanmış ve genom çapında RNAi besleme kütüphaneleri ve binlerce mutant ve transgenik suş da dahil olmak üzere bir dizi güçlü genetik araç yaratılmıştır. Tarihsel olarak, C. elegans katı agar nematod büyüme ortamı (NGM) üzerinde popülasyonlar olarak yetiştirilir ve fenotipler doğrudan gözlem veya görüntüleme ve aşağı akış analizi ile manuel olarak değerlendirilir. Floresan mikroskopi, bireysel C. elegans’ta boyalar veya transjenik olarak eksprese edilmiş floresan etiketleri kullanarak çeşitli moleküler fenotipleri yakalamak için kullanılır.Floresan görüntüleme tipik olarak, bir hayvanı invaziv ve genellikle ölümcül olan ince agaroz pedleri içeren slaytlara sabitlemeyi veya felç etmeyi içerir. Ayrıca, levamisol veya sodyum azid gibi kimyasalların kullanımını da içerir ve bu da potansiyel olarak ilgilenilen moleküler sürece müdahale edebilir 2,3. Birlikte, bu yaklaşımlar kesitsel, popülasyon düzeyinde verilerin geniş bir fenotip yelpazesinde toplanmasına izin verir, ancak zaman içinde bireysel hayvanların izlenmesine izin vermez.
Son yıllarda, izole C. elegans’ı yetiştirmek için çeşitli yaklaşımlar ortaya çıkmış ve araştırmacıların yeni görüntüleme teknolojilerini kullanarak zaman içinde hayvanların fizyolojik ve moleküler fenotiplerindeki dinamik değişiklikleri yakalamalarına olanak sağlamıştır. C. elegans kültür yaklaşımının bir kategorisi, WormFarm4, Nemalife çip5 ve Chronis ve ark.6’nın ‘davranış’ çipi de dahil olmak üzere mikroakışkan cihazlardırve diğerleri 7,8,9’dur. Bunlarla ilgili olarak, zaman içinde bireysel solucanları veya küçük popülasyonları karakterize etmek için çok kuyucuklu plakalar kullanan sıvı bazlı kültür yöntemlerivardır 10,11. Mikroakışkanlar ve mikroplaka sistemleri, C. elegans’taki fenotipik tepkilerin tek bir hayvana kadar mükemmel nicel ölçümlerini sağlar, ancak kültür ortamı önemli bir sınırlama sunar. C. elegans’ta, özellikle yaşlanma alanında, geçmiş araştırmaların büyük çoğunluğu, katı agar bazlı medya üzerinde tamamlanmıştır. Sıvı kültür, C. elegans’ın sürekli yüzmesine neden olur ve altta yatan biyolojiyi değiştirebilecek farklı bir çevresel bağlamı temsil eder. Örneğin, sıvı ortamda kültürlenen hayvanlar, agar bazlı katı NGM12,13 üzerinde kültürlenen hayvanlara göre, yağ içeriğini ve gen ekspresyonunu – özellikle stres tepkisinde yer alan genler için – büyük ölçüde değiştirmiştir. Tek hayvanlı görüntüleme yöntemlerinin alternatif bir kategorisi, Petri plakaları üzerindeki grup kültüründe katı NGM üzerinde kültürlenen solucanların yaşadığı standart ortamı daha yakından taklit etmek amacıyla, katı ortam üzerinde bireysel hayvanları izole eden polidimetilsiloksan (PDMS) cihazlarını içerir. WorMotel, bireysel hayvanları katı ortamlarda kültürlemek için tasarlanmış 240 kuyucuklu bir PDMS cihazıdır. Her kuyucuk, agar yerine düşük erimeli agaroz kullanılarak modifiye edilmiş bir NGM ile doldurulur ve bakteriyel gıdalarla tohumlanır, böylece Petri plakaları kullanılarak en yaygın kültür sistemine benzer katı bir ortam ortamı yaratılır. Kuyu duvarları yuvarlaktır ve kuyudaki konumdan bağımsız olarak her hayvanın görüntülenmesine izin verir (çok kuyulu bir plakadaki bir duvarın yakınındaki bir hayvanın neden olduğu görsel belirsizlikten kaçınır). Her kuyuyu çevreleyen dar bir hendekte bulunan bakır sülfat, hayvanları kuyularında tutmak için caydırıcı olarak kullanılır14,15. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, bakır sülfatın, diyet kısıtlaması, patojenik bakteriler veya hücresel strese neden olan kimyasallar (örneğin, paraquat) dahil olmak üzere engelleyici çevresel koşullar mevcut olduğunda solucanların kaçmasını önlemede etkisiz olmasıdır.
Katı ortam kullanan ikinci bir sistem, bir slayttaki her solucan için küçük bir sızdırmaz ortam oluşturmak için bir hidrojel kullanan ve bireysel olarak izole edilmiş hayvanların uzun süreli izlenmesine izin veren Worm Corral’dır16. Önemli bir sınırlama, hayvanların yumurta olarak çevreye kapatılması gerektiği, üremeyi önlemek için steril hayvanların kullanılmasını gerektirmesi ve ilaç tedavilerinin tek bir uygulamayla sınırlandırılmasıdır. Çok dozlu ilaç denemeleri, WorMotel’de solucanları cihaza aktarmadan önce birden fazla maruz kalma turu gerçekleştirerek veya deney sırasında kuyucuklara topikal olarak ek ilaçlar ekleyerek gerçekleştirilebilir; Bununla birlikte, ikinci durumda, mevcut bir kuyucuğa ek bir ilaç eklendikten sonra gerçek maruz kalma dozunun kesin olarak ölçülmesi zordur ve ilacın ne kadar hızlı bozulduğuna bağlıdır. Hem WorMotel hem de Worm Corral, aktivite ve hayvan fizyolojisi (örneğin, büyüme ve gelişme) ile ilgili bilgileri yakalamak için parlak alan veya karanlık alan görüntüleme için mükemmeldir. Bu sistemler floresanı izlemek için kullanılabilse de, deneyimlerimize göre, diğer tek solucanlı görüntüleme teknolojilerini oluşturmak için kullanılan PDMS, özellikle C. elegans araştırmasında kullanılan en yaygın florofor olan GFP emisyon aralığında, tutarlı floresan görselleştirme ve nicelleştirmeye müdahale eden düzensiz floresan artefaktlar üreten mikrokabarcıklar oluşturmaya, partikülleri yakalamaya ve diğer küçük anormalliklere eğilimlidir. Bugüne kadar, C. elegans bireysel hayvanlarının uzunlamasına bir şekilde canlı floresan görüntülemesi öncelikle mikroakışkan cihazlara dayanmaktadır17.
Burada, bireysel C. elegans’ı katı ortam üzerinde kültürlemek için hem engelleyici müdahaleler hem de doğrudan floresan görüntüleme ile uyumlu yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşım, özel olarak kalıplanmış PDMS çipinin, başlangıçta mikro sitotoksisite testleri için geliştirilen ticari olarak temin edilebilen polistiren mikro tepsilerle (yaygın olarak Terasaki tepsileri olarak da adlandırılır) değiştirilmesi dışında, konsept olarak diğer tek solucanlı görüntüleme teknolojilerine benzerdir18. Bu mikro tepsiler, katı ortamlarla doldurulabilen ve bakteriyel gıdalarla tohumlanabilen, standart katı NGM kültür metodolojisi altında hayvanların yaşadığı çevreyi yakından taklit eden kuyucuklara sahiptir. Her kuyu, bakır sülfat yerine palmitik asidin engelleyici bir bariyeri ile çevrilidir. Palmitik asit, solucanların katı ortamlardan kaçmasını önlemek için, solucanların diyet kısıtlaması veya kimyasal bir stresöre maruz kalma gibi engelleyici bir ortamla zorlandığı deneylerde Petri plakaları üzerinde standart grup kültürünü kullanarak yaygın olarak kullanılır. Mikro tepsiler ayrıca minimal ve tutarlı floresan arka plan üreterek hayvanların doğrudan kültür ortamlarında floresan görüntülemesine olanak tanır. Bu yeni tek hayvanlı katı agar tabanlı kültür sistemi, yalnızca yaşam boyunca bireysel hayvanların izlenmesine ve büyümenin, gelişmenin, aktivitenin ve ömrün izlenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda doğrudan floresan mikroskobu ile de uyumludur. Solucanlar felç veya fiksasyon olmadan görüntülenebildiğinden, in vivo floresan biyobelirteçleri, kültür ortamlarında kalan bireysel hayvanlarda uzunlamasına ölçülebilir ve her hayvanın ömrü boyunca dinamik değişikliklerin gözlemlenmesine izin verir. Bu kültür sistemi, kullanım ömrünü ve diğer sağlık ölçümlerini izlemek için mevcut nesil otomatik sistemlerle de uyumludur14,19. Bu mikrotepsi tabanlı sistemde bireysel C. elegans’ı kültürlemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, potansiyel tuzakları ve sorun gidermeyi tartışıyoruz ve diğer sistemlere göre avantajları ve sınırlamaları ve özellikle güncellenmiş ve optimize edilmiş bir WorMotel protokolü15’i tartışıyoruz.
Her tek solucan kültürü ortamı, özel bir 3B yazdırılmış adaptör kullanılarak standart bir tek kuyucuklu tepsinin içine monte edilmiş bir mikro tepsiden oluşur (Şekil 1A). Kuyucuklar düşük erimeli agaroz nematod büyüme ortamı (lmNGM) ile doldurulur, besin kaynağı olarak konsantre bakterilerle tohumlanır ve solucanların kaçmasını önlemek için palmitik asit kaplaması ile çevrilidir (Şekil 1B). Mikro tepsi ile tek kuyucuklu plakanın duvarları arasındaki boşluk, nemi korumak için doymuş su kristalleri ile doldurulur (Şekil 1B). Yoğuşmayı önlemek için tepsi kapağına bir deterjan kaplaması uygulanır. Her bir kuyucuğa tek bir solucan eklenir ve tek kuyucuklu tepsi, nemi korumak ve oksijen değişimine izin vermek için Parafilm ile kapatılır. Altı adede kadar mikro tepsi, tek bir deneyimli araştırmacı tarafından paralel olarak makul bir şekilde hazırlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, başlangıçta insan lökosit antijen doku tipleme testleri için geliştirilen mikro tepsileri, C. elegans araştırmasında standart olan agar bazlı NGM’ye bağlamsal olarak benzeyen katı bir ortam ortamında tek C. elegans’ın zaman içinde izolasyonuna ve karakterizasyonuna izin verecek şekilde uyarlayan yeni bir kültür sistemini açıklıyoruz. Bu sistem, diyet kısıtlaması, eksojen ilaç tedavisi, kimyasal veya çevresel stresörlerle ilgili bir zorluk ve RNAi dahil olmak üzere çe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, G.L.S.’ye NIH R35GM133588, L.E.’ye bir NIHT32GM008659 eğitim hibesi, G.L.S.’ye Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Tıp Akademisi Katalizör Ödülü ve Arizona Eyaleti Teknoloji ve Araştırma Girişimi Fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 3D-printed terasaki inserts | Custom printing company | Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL |
FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament |
| AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood | Fisher Scientific | 36-100-4376 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| CaCl2 | Acros organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | Goldbio | C-103-25 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| FUdR | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hydrating water crystals | M2 Polymer Technologies | Type S | Type S super absorbent polymer |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Leica K5 sCMOS monochrome camera | Leica Microsystems | 11547112 | |
| Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope | Leica Microsystems | 10450826 | |
| Low-melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| NaCl | Fisher bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Scientific | 264728 | |
| Nystatin | Sigma | N1538 | |
| Palmitic acid | Acros organics | 129700010 | |
| Paper towels | Coastwide Professional | 365374 | |
| Parafilm M | Parafilm | 16-101 | |
| Stratagene UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075 | UV crosslinker |
| Terasaki trays (Lambda) | One Lambda | 151431 | |
| Thermolyne Dri-bath | Thermolyne | DB28125 | |
| Tween | Thermo Scientific | J20605-AP |
References
- Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).
- Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
- Çelen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
- Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
- Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
- . Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021)
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142 (2013).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).
- Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
- Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).
- Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
- Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).
