Malakitgrøn analyse til opdagelse af varmechokprotein 90-hæmmere
Summary
Malachitgrøn assay-protokollen er en enkel og omkostningseffektiv metode til at opdage varmechokprotein 90 (Hsp90) suppressorer samt andre inhibitorforbindelser mod ATP-afhængige enzymer.
Abstract
Varmechokprotein 90 (Hsp90) er et lovende anticancermål på grund af dets chaperonerende effekt på flere onkogene proteiner. Aktiviteten af Hsp90 er afhængig af dets evne til at hydrolysere adenosintrifosfat (ATP) til adenosindiphosphat (ADP) og frit fosfat. ATPase-aktiviteten af Hsp90 er knyttet til dens chaperoning-funktion; ATP binder sig til Hsp90’s N-terminale domæne, og afbrydelse af dets binding viste sig at være den mest succesrige strategi til at undertrykke Hsp90-funktionen. ATPaseaktiviteten kan måles ved et kolorimetrisk malachitgrønt assay, som bestemmer mængden af frit fosfat dannet ved ATP-hydrolyse. Her beskrives en procedure til bestemmelse af ATPaseaktiviteten af gær Hsp90 ved anvendelse af malachitgrønt fosfatanalysesæt. Yderligere gives detaljerede instruktioner til opdagelsen af Hsp90-hæmmere ved at tage geldanamycin som en autentisk hæmmer. Endelig diskuteres anvendelsen af denne assayprotokol gennem high-throughput screening (HTS) af inhibitormolekyler mod gær Hsp90.
Introduction
Varmechokprotein 90 (Hsp90) er en molekylær chaperon, der opretholder stabiliteten af proteiner, der er ansvarlige for udvikling og progression af kræft. Derudover er proteiner, der er ansvarlige for udviklingen af resistens over for antineoplastiske midler, også klienter af Hsp901. Hsp90 er allestedsnærværende i alle kræftcelletyper (>90% af cellulære proteiner) sammenlignet med normale celler, hvor det kan udgøre mindre end 2% af de samlede proteiner. Desuden befinder kræftcellernes Hsp90 sig i et kompleks med co-chaperoner, mens det i en normal celle overvejende er til stede i en fri, ukomplekset tilstand 2,3. I de senere år har flere Hsp90-hæmmere vist sig at have senolytiske virkninger i in vitro- og in vivo-studier, hvor de signifikant har forbedret levetiden for mus 4,5,6. Alle de ovennævnte resultater underbygger det faktum, at Hsp90-hæmmere kan være effektive i flere kræfttyper med færre bivirkninger og reducerede chancer for at udvikle resistens. Chaperoneringsfunktionen af Hsp90 opnås ved at binde ATP på det N-terminale domæne af Hsp90 og hydrolysere det til ADP og frit fosfat7. Små molekyler, der konkurrencedygtigt binder til ATP-bindingslommen af Hsp90, viste sig at undertrykke proteinets chaperonerende virkning. Til dato er dette fortsat den bedste strategi for Hsp90-hæmning, hvilket understøttes af, at sådanne hæmmere har nået kliniske forsøg8. En af dem, Pimitespib, blev godkendt i Japan til behandling af gastrointestinal stromal tumor (GIST) i juni 20229. Dette er den første Hsp90-hæmmer godkendt siden lægemidletgabilitet af chaperon blev etableret i 199410.
Malachitgrøn analyse er en enkel, følsom, hurtig og billig procedure til påvisning af uorganisk fosfat, egnet til automatisering og high-throughput screening (HTS) af forbindelser mod det ønskede mål11. Analysen er med succes blevet anvendt til screening af Hsp90-hæmmere i små laboratorieskalaopsætninger såvel som i en HTS 12,13,14,15,16,17. Assayet bruger en kolorimetrisk metode, der bestemmer det frie uorganiske fosfat dannet på grund af ATPase-aktiviteten af Hsp90. Grundlaget for denne kvantificering er dannelsen af et phosphomolybdatkompleks mellem frit phosphat og molybdæn, som efterfølgende reagerer med malachitgrøn for at generere en grøn farve (figur 1). Denne hurtige farvedannelse måles på et spektrofotometer eller på en pladelæser mellem 600-660 nm18,19.
I denne protokol beskrives proceduren for udførelse af et malachitgrønt assay med gær Hsp90 og efterfølgende identifikation af inhibitorer mod chaperonen. Det naturlige produktmolekyle, geldanamycin (GA), med hvilket lægemiddelbarheden af Hsp90 først blev etableret, blev taget som en autentisk hæmmer10. HTS er blevet en integreret del af det nuværende lægemiddelforskningsprogram på grund af tilgængeligheden af et stort antal molekyler til testning. Denne teknik har fået større betydning i de sidste 2 år på grund af det presserende behov for genanvendelse af lægemidler til behandling af Covid-19-infektion20,21. Derfor præsenteres en detaljeret oversigt over HTS af molekyler mod gær Hsp90-protein ved at vedtage den malachitgrønne analysemetode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hsp90 er et vigtigt mål for opdagelsen af nye anticancer-lægemiddelmolekyler. Siden dets lægemiddelbarhed blev etableret i 1994, har10, 18 molekyler nået kliniske forsøg. På nuværende tidspunkt er syv molekyler i forskellige faser af kliniske forsøg, enten alene eller i kombination22. Alle sådanne små molekyler er N-terminale ATP-bindende hæmmere. De andre midler til at hæmme chaperon (C-terminale hæmmere, mellemdomænehæmmere) er ikke gået så hurtigt som N-…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Korea Research Fellowship (KRF) -programmet, postdoc ved National Research Foundation of Korea (NRF), finansieret af ministeriet for videnskab og IKT (NRF-2019H1D3A1A01102952). Forfatterne er taknemmelige for KIST intramural grant og Ministry of Oceans and Fisheries bevilling nummer 2MRB130 for at yde økonomisk bistand til dette projekt.
Materials
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
References
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
- Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
- Park, H. -. K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
- Hoy, S. M. Pimitespib: first approval. Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).
- Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Sheikha, G. A., Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
- Al-Sha’er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
- Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
- Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
- Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
- Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
- Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
- Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , 107-122 (2021).
- Jaeger, A. M., Whitesell, L. HSP90: enabler of cancer adaptation. Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).
- Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
- Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
- Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
- Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
- Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
- Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
- Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
- Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
- Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).
