हीट-शॉक प्रोटीन 90 इनहिबिटर की खोज के लिए मैलाकाइट ग्रीन परख
Summary
मैलाकाइट ग्रीन परख प्रोटोकॉल हीट शॉक प्रोटीन 90 (एचएसपी 90) सप्रेसर्स, साथ ही एटीपी-निर्भर एंजाइमों के खिलाफ अन्य अवरोधक यौगिकों की खोज के लिए एक सरल और लागत प्रभावी तरीका है।
Abstract
हीट शॉक प्रोटीन 90 (एचएसपी 90) एक आशाजनक एंटीकैंसर लक्ष्य है क्योंकि कई ऑन्कोजेनिक प्रोटीन पर इसका चैपरोनिंग प्रभाव होता है। एचएसपी 90 की गतिविधि एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) को एडेनोसिन डाइफॉस्फेट (एडीपी) और मुक्त फॉस्फेट को हाइड्रोलाइज करने की क्षमता पर निर्भर है। एचएसपी 90 की एटीपीस गतिविधि इसके चैपरोनिंग फ़ंक्शन से जुड़ी हुई है; एटीपी एचएसपी 90 के एन-टर्मिनल डोमेन को बांधता है, और इसके बंधन को बाधित करना एचएसपी 90 फ़ंक्शन को दबाने में सबसे सफल रणनीति पाई गई। एटीपीस गतिविधि को एक कलरिमेट्रिक मैलाकाइट ग्रीन परख द्वारा मापा जा सकता है, जो एटीपी हाइड्रोलिसिस द्वारा गठित मुक्त फॉस्फेट की मात्रा निर्धारित करता है। यहां, मैलाकाइट ग्रीन फॉस्फेट परख किट का उपयोग करके खमीर एचएसपी 90 की एटीपीस गतिविधि को निर्धारित करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, एक प्रामाणिक अवरोधक के रूप में गेल्डानामाइसिन लेने से एचएसपी 90 अवरोधकों की खोज के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान किए गए हैं। अंत में, खमीर एचएसपी 90 के खिलाफ अवरोधक अणुओं के उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) के माध्यम से इस परख प्रोटोकॉल के आवेदन पर चर्चा की गई है।
Introduction
हीट शॉक प्रोटीन 90 (एचएसपी 90) एक आणविक चैपरोन है जो कैंसर के विकास और प्रगति के लिए जिम्मेदार प्रोटीन की स्थिरता को बनाए रखता है। इसके अलावा, एंटीनोप्लास्टिक एजेंटों के प्रतिरोध के विकास के लिए जिम्मेदार प्रोटीन भी एचएसपी 901 के ग्राहक हैं। सामान्य कोशिकाओं की तुलना में सभी कैंसर सेल प्रकारों (>90% सेलुलर प्रोटीन) में एचएसपी 90 सर्वव्यापी रूप से अतिरंजित होता है, जहां यह कुल प्रोटीन के 2% से कम हो सकता है। इसके अलावा, कैंसर कोशिकाओं का एचएसपी 90 सह-चैपरोन के साथ एक परिसर में रहता है, जबकि एक सामान्य कोशिका में यह मुख्य रूप से एक मुक्त, गैर-जटिल अवस्था 2,3 में मौजूद होता है। हाल के वर्षों में, कई एचएसपी 90 अवरोधकों को इन विट्रो और विवो अध्ययनों में सेनोलिटिक प्रभाव रखने के लिए प्रदर्शित किया गया है, जहां उन्होंने चूहों के जीवन काल 4,5,6 में काफी सुधार किया है। उपरोक्त सभी निष्कर्ष इस तथ्य को प्रमाणित करते हैं कि एचएसपी 90 अवरोधक कई कैंसर प्रकारों में प्रभावी हो सकते हैं, कम प्रतिकूल प्रभाव और प्रतिरोध विकसित करने की संभावना कम हो सकती है। एचएसपी 90 के चैपरोनिंग फ़ंक्शन को एचएसपी 90 के एन-टर्मिनल डोमेन पर एटीपी को बांधकर और इसे एडीपी और फ्री फॉस्फेट7 में हाइड्रोलाइज करके पूरा किया जाता है। एचएसपी 90 के एटीपी बाइंडिंग पॉकेट से प्रतिस्पर्धात्मक रूप से जुड़ने वाले छोटे अणु प्रोटीन के चैपरोनिंग प्रभाव को सफलतापूर्वक दबाने के लिए पाए गए। आज तक, यह एचएसपी 90 निषेध के लिए सबसे अच्छी रणनीति बनी हुई है, जो इस तथ्य से समर्थित है कि ऐसे अवरोधक नैदानिक परीक्षणों8 तक पहुंच गए हैं। उनमें से एक, पिमिट्सपिब, जून 2022 9 में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर (जीआईएसटी) के इलाज के लिए जापान में अनुमोदितकिया गया था। यह पहला एचएसपी 90 अवरोधक है जिसे 199410 में चैपरोन की दवा की स्थापना के बाद से अनुमोदित किया गया था।
मैलाकाइट ग्रीन परख अकार्बनिक फॉस्फेट का पता लगाने के लिए एक सरल, संवेदनशील, तेज और सस्ती प्रक्रिया है, जो स्वचालन और यौगिकों के उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) के लिए उपयुक्तहै। परख को छोटे प्रयोगशाला-पैमाने के सेटअपों में एचएसपी 90 अवरोधकों की स्क्रीनिंग के साथ-साथ एचटीएस12,13,14,15,16,17 में सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है। परख एक रंगीन विधि का उपयोग करती है जो एचएसपी 90 की एटीपीस गतिविधि के कारण गठित मुक्त अकार्बनिक फॉस्फेट को निर्धारित करती है। इस परिमाणीकरण का आधार मुक्त फॉस्फेट और मोलिब्डेनम के बीच एक फॉस्फोमोलिबिट कॉम्प्लेक्स का गठन है, जो बाद में हरे रंग को उत्पन्न करने के लिए मैलाकाइट हरे रंग के साथ प्रतिक्रिया करता है (चित्रा 1)। इस तेजी से रंग गठन को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर, या प्लेट रीडर पर 600-660 एनएम18,19 के बीच मापा जाता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, खमीर एचएसपी 90 के साथ एक मैलाकाइट ग्रीन परख करने और चैपरोन के खिलाफ अवरोधकों की बाद की पहचान करने की प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। प्राकृतिक उत्पाद अणु, गेल्डामाइसिन (जीए), जिसके साथ एचएसपी 90 की दवा पहली बार स्थापित की गई थी, को एक प्रामाणिक अवरोधक10 के रूप में लिया गया था। एचटीएस परीक्षण के लिए बड़ी संख्या में अणुओं की उपलब्धता के कारण वर्तमान दवा खोज कार्यक्रम का एक अभिन्न अंग बन गया है। इस तकनीक ने पिछले 2 वर्षों में अधिक महत्व प्राप्त किया है क्योंकि कोविद -19 संक्रमण20,21 के इलाज के लिए दवाओं को पुन: तैयार करने की तत्काल आवश्यकता है। इसलिए, मैलाकाइट ग्रीन परख विधि को अपनाकर खमीर एचएसपी 90 प्रोटीन के खिलाफ अणुओं के एचटीएस के लिए एक विस्तृत रूपरेखा प्रस्तुत की गई है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचएसपी 90 उपन्यास एंटीकैंसर दवा अणुओं की खोज के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है। चूंकि इसकी दवा 199410 में स्थापित की गई थी, 18 अणु नैदानिक परीक्षणों तक पहुंच गए हैं। वर्तमान में, सात अणु नैदानिक परीक्षण?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को कोरिया रिसर्च फैलोशिप (केआरएफ) कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, जो कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) के पोस्टडॉक्टोरल फेलो थे, जो विज्ञान और आईसीटी मंत्रालय (एनआरएफ -2019 एच 1 डी 3 ए 1 ए 01102952) द्वारा वित्त पोषित थे। लेखक इस परियोजना के लिए वित्तीय सहायता प्रदान करने के लिए केआईएसटी इंट्राम्यूरल अनुदान और महासागर और मत्स्य पालन मंत्रालय अनुदान संख्या 2एमआरबी 130 के आभारी हैं।
Materials
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
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