Ensaio verde de malaquita para a descoberta de inibidores da proteína de choque térmico 90
Summary
O protocolo de ensaio verde de malaquita é um método simples e econômico para descobrir supressores de proteína de choque térmico 90 (Hsp90), bem como outros compostos inibidores contra enzimas dependentes de ATP.
Abstract
A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é um alvo anticâncer promissor devido ao seu efeito de chaperoning sobre múltiplas proteínas oncogênicas. A atividade da Hsp90 é dependente de sua capacidade de hidrolisar adenosina trifosfato (ATP) em adenosina difosfato (ADP) e fosfato livre. A atividade ATPase da Hsp90 está ligada à sua função de chaperoning; ATP liga-se ao domínio N-terminal do Hsp90, e interromper sua ligação foi encontrado para ser a estratégia mais bem sucedida na supressão da função Hsp90. A atividade da ATPase pode ser medida por um ensaio colorimétrico verde de malaquita, que determina a quantidade de fosfato livre formado pela hidrólise de ATP. Aqui, um procedimento para determinar a atividade ATPase da levedura Hsp90 usando o kit de ensaio de fosfato verde de malaquita é descrito. Além disso, instruções detalhadas para a descoberta de inibidores de Hsp90 tomando geldanamicina como um inibidor autêntico é fornecida. Finalmente, a aplicação deste protocolo de ensaio através da triagem de alto rendimento (HTS) de moléculas inibidoras contra a levedura Hsp90 é discutida.
Introduction
A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é uma chaperona molecular que mantém a estabilidade de proteínas responsáveis pelo desenvolvimento e progressão do câncer. Além disso, proteínas responsáveis pelo desenvolvimento de resistência a agentes antineoplásicos também são clientes da Hsp901. A Hsp90 é superexpressa de forma ubíqua em todos os tipos de células cancerosas (>90% das proteínas celulares), em comparação com as células normais, onde pode constituir menos de 2% das proteínas totais. Além disso, a Hsp90 das células cancerosas reside em um complexo com cochaperonas, enquanto em uma célula normal está presente predominantemente em um estado livre e nãocomplexado 2,3. Nos últimos anos, vários inibidores de Hsp90 demonstraram possuir efeitos senolíticos em estudos in vitro e in vivo, onde melhoraram significativamente o tempo de vida de camundongos 4,5,6. Todos os achados acima corroboram o fato de que os inibidores de Hsp90 poderiam ser efetivos em múltiplos tipos de câncer, com menos efeitos adversos e menores chances de desenvolver resistência. A função de chaperoning da Hsp90 é realizada ligando-se ao ATP no domínio N-terminal da Hsp90 e hidrolisando-o em ADP e fosfato livre7. Pequenas moléculas que se ligam competitivamente à bolsa de ligação de ATP de Hsp90 foram encontradas para suprimir com sucesso o efeito de chaperoning da proteína. Até o momento, essa continua sendo a melhor estratégia para a inibição da Hsp90, o que é apoiado pelo fato de tais inibidores terem chegado a ensaios clínicos8. Um deles, o Pimitespib, foi aprovado no Japão para o tratamento do tumor estromal gastrointestinal (GIST) em junho de 20229. Este é o primeiro inibidor de Hsp90 aprovado desde que a farmacogabilidade da chaperona foi estabelecida em 199410.
O ensaio verde de malaquita é um procedimento simples, sensível, rápido e de baixo custo para a detecção de fosfato inorgânico, adequado para automação e triagem de alto rendimento (HTS) de compostos contra seu alvo desejado11. O ensaio foi empregado com sucesso para a triagem de inibidores de Hsp90 em pequenos montamentos em escala laboratorial, bem como em uma HTS 12,13,14,15,16,17. O ensaio utiliza um método colorimétrico que determina o fosfato inorgânico livre formado devido à atividade ATPase da Hsp90. A base dessa quantificação é a formação de um complexo fosfomolibdato entre fosfato livre e molibdênio, que posteriormente reage com o verde malaquita para gerar uma cor verde (Figura 1). Essa rápida formação de cor é medida em espectrofotômetro, ou em leitor de placas, entre 600-660 nm18,19.
No presente protocolo, descreve-se o procedimento para a realização do ensaio verde de malaquita com a levedura Hsp90 e posterior identificação de inibidores contra a chaperona. A molécula do produto natural, geldanamicina (GA), com a qual a farmacogabilidade da Hsp90 foi estabelecida pela primeira vez, foi tomada como um inibidor autêntico10. A HTS tornou-se parte integrante do atual programa de descoberta de fármacos, devido à disponibilidade de um grande número de moléculas para testes. Essa técnica ganhou mais importância nos últimos 2 anos devido à necessidade urgente de reaproveitamento de medicamentos para o tratamento da infecção por Covid-1920,21. Portanto, um esboço detalhado para a HTS de moléculas contra a proteína Hsp90 da levedura adotando o método de ensaio verde de malaquita é apresentado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hsp90 é um alvo significativo para a descoberta de novas moléculas de drogas anticancerígenas. Desde que sua farmacogabilidade foi estabelecida em 199410, 18 moléculas chegaram a ser experimentadas clinicamente. Atualmente, sete moléculas estão em várias fases de ensaios clínicos, isoladamente ou em combinação22. Todas essas pequenas moléculas são inibidores de ligação do ATP N-terminal. Os outros meios de inibir a chaperona (inibidores C-terminais, inibidores…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo programa Korea Research Fellowship (KRF), pós-doutorado da National Research Foundation of Korea (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência e ICT (NRF-2019H1D3A1A01102952). Os autores agradecem à subvenção intramuros KIST e à subvenção número 2MRB130 do Ministério dos Oceanos e Pescas por fornecerem assistência financeira para este projeto.
Materials
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
References
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
- Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
- Park, H. -. K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
- Hoy, S. M. Pimitespib: first approval. Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).
- Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Sheikha, G. A., Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
- Al-Sha’er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
- Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
- Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
- Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
- Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
- Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
- Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , 107-122 (2021).
- Jaeger, A. M., Whitesell, L. HSP90: enabler of cancer adaptation. Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).
- Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
- Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
- Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
- Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
- Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
- Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
- Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
- Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
- Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).
