Malakitgrön analys för upptäckt av värmechockprotein 90-hämmare
Summary
Malakitgrönt analysprotokoll är en enkel och kostnadseffektiv metod för att upptäcka värmechockprotein 90 (Hsp90) suppressorer, liksom andra inhibitorföreningar mot ATP-beroende enzymer.
Abstract
Värmechockprotein 90 (Hsp90) är ett lovande anticancermål på grund av dess chaperoning effekt på flera onkogena proteiner. Aktiviteten hos Hsp90 är beroende av dess förmåga att hydrolysera adenosintrifosfat (ATP) till adenosindifosfat (ADP) och fritt fosfat. ATPas-aktiviteten hos Hsp90 är kopplad till dess chaperoningsfunktion; ATP binder till N-terminaldomänen för Hsp90, och att störa dess bindning visade sig vara den mest framgångsrika strategin för att undertrycka Hsp90-funktionen. ATPas-aktiviteten kan mätas med en kolorimetrisk malakitgrön analys, som bestämmer mängden fritt fosfat bildat genom ATP-hydrolys. Här beskrivs ett förfarande för bestämning av ATPas-aktiviteten hos jäst Hsp90 med hjälp av malakitgrönt fosfatanalyssats. Vidare ges detaljerade instruktioner för upptäckten av Hsp90-hämmare genom att ta geldanamycin som en autentisk hämmare. Slutligen diskuteras tillämpningen av detta analysprotokoll genom high-throughput screening (HTS) av inhibitormolekyler mot jäst Hsp90.
Introduction
Värmechockprotein 90 (Hsp90) är en molekylär chaperon som upprätthåller stabiliteten hos proteiner som är ansvariga för utveckling och progression av cancer. Dessutom är proteiner som är ansvariga för utvecklingen av resistens mot antineoplastiska medel också kunder av Hsp901. Hsp90 överuttrycks allestädes närvarande i alla cancercelltyper (>90% av cellulära proteiner), jämfört med normala celler där det kan utgöra mindre än 2% av det totala proteinet. Dessutom finns Hsp90 av cancerceller i ett komplex med co-chaperoner, medan det i en normal cell huvudsakligen förekommer i ett fritt, okomplext tillstånd 2,3. Under de senaste åren har flera Hsp90-hämmare visat sig ha senolytiska effekter i in vitro– och in vivo-studier, där de signifikant har förbättrat livslängden hos möss 4,5,6. Alla ovannämnda fynd bekräftar det faktum att Hsp90-hämmare kan vara effektiva i flera cancertyper, med färre biverkningar och minskad risk att utveckla resistens. Chaperoneringsfunktionen för Hsp90 åstadkoms genom att binda ATP vid N-terminaldomänen för Hsp90 och hydrolysera den till ADP och fritt fosfat7. Små molekyler som kompetitivt binder till ATP-bindningsfickan av Hsp90 visade sig framgångsrikt undertrycka proteinets chaperoningseffekt. Hittills är detta fortfarande den bästa strategin för Hsp90-hämning, vilket stöds av det faktum att sådana hämmare har nått kliniska prövningar8. En av dem, Pimitespib, godkändes i Japan för behandling av gastrointestinal stromacellstumör (GIST) i juni 20229. Detta är den första Hsp90-hämmaren som godkänts sedan chaperonens drogbarhet etablerades 199410.
Den malakitgröna analysen är en enkel, känslig, snabb och billig procedur för detektion av oorganiskt fosfat, lämplig för automatisering och screening med hög genomströmning (HTS) av föreningar mot dess önskade mål11. Analysen har framgångsrikt använts för screening av Hsp90-hämmare i små laboratorieskalor, liksom i en HTS 12,13,14,15,16,17. Analysen använder en kolorimetrisk metod som bestämmer det fria oorganiska fosfatet bildat på grund av ATPas-aktiviteten hos Hsp90. Grunden för denna kvantifiering är bildningen av ett fosfomolybdatkomplex mellan fritt fosfat och molybden, som därefter reagerar med malakitgrön för att generera en grön färg (figur 1). Denna snabba färgbildning mäts på en spektrofotometer, eller på en plattläsare, mellan 600-660 nm18,19.
I detta protokoll beskrivs förfarandet för att utföra en malakitgrön analys med jäst Hsp90 och efterföljande identifiering av hämmare mot chaperonen. Den naturliga produktmolekylen, geldanamycin (GA), med vilken läkemedelsbarheten för Hsp90 först fastställdes, togs som en autentisk hämmare10. HTS har blivit en integrerad del av det nuvarande läkemedelsupptäcktsprogrammet på grund av tillgången på ett stort antal molekyler för testning. Denna teknik har fått större betydelse under de senaste 2 åren på grund av det akuta behovet av återanvändning av läkemedel för behandling av Covid-19-infektion20,21. Därför presenteras en detaljerad översikt för HTS av molekyler mot jäst Hsp90-protein genom att anta malakitgrön analysmetod.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hsp90 är ett viktigt mål för upptäckten av nya läkemedelsmolekyler mot cancer. Sedan dess läkemedelsförmåga etablerades 199410, 18 molekyler har nått kliniska prövningar. För närvarande befinner sig sju molekyler i olika faser av kliniska prövningar, antingen ensamma eller i kombination22. Alla sådana små molekyler är N-terminala ATP-bindande hämmare. De andra sätten att hämma chaperonen (C-terminala hämmare, mellandomänhämmare) har inte gått lika sna…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Korea Research Fellowship (KRF) -programmet, postdoktor vid National Research Foundation of Korea (NRF), finansierat av ministeriet för vetenskap och IKT (NRF-2019H1D3A1A01102952). Författarna är tacksamma för KIST intramural grant och Ministry of Oceans and Fisheries grant nummer 2MRB130 för att ge ekonomiskt stöd till detta projekt.
Materials
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
References
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
- Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
- Park, H. -. K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
- Hoy, S. M. Pimitespib: first approval. Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).
- Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Sheikha, G. A., Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
- Al-Sha’er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
- Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
- Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
- Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
- Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
- Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
- Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , 107-122 (2021).
- Jaeger, A. M., Whitesell, L. HSP90: enabler of cancer adaptation. Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).
- Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
- Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
- Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
- Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
- Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
- Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
- Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
- Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
- Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).
