ここでは、向流遠心分離システムを使用して、多層フラスコから接着細胞を密閉半自動方式で回収するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、既存のステップにほとんど変更を加えることなく、他の細胞増殖プラットフォームから接着細胞と浮遊細胞の両方を回収するために適用できます。
ヒト間葉系幹細胞(hMSC)は現在、さまざまな疾患の有望な細胞ベースの治療法として探求されており、今後数年間で臨床使用のためのより多くの市場承認が見込まれています。この移行を促進するには、規模、ロット間の再現性、コスト、規制コンプライアンス、品質管理のボトルネックに対処することが重要です。これらの課題は、プロセスを終了し、自動化された製造プラットフォームを採用することで対処できます。本研究では、ウォートンゼリー(WJ)由来のhMSC(WJ-hMSC)を向流遠心分離を用いて多層フラスコから継代および回収するための閉鎖および半自動プロセスを開発しました。WJ-hMSCは、規制に準拠した無血清ゼノフリー(SFM XF)培地を使用して拡張され、従来の血清含有培地で拡張されたWJ-hMSCと同等の細胞増殖(集団倍増)および形態を示しました。当社のクローズド半自動ハーベスティングプロトコルは、高い細胞回収率(~98%)と生存率(~99%)を示しました。細胞を洗浄し、WJ-hMSC表面マーカー発現、コロニー形成単位(CFU-F)、三系統分化能、およびサイトカイン分泌プロファイルを維持したカウンターフロー遠心分離を用いて濃縮した。本研究で開発された半自動細胞採取プロトコルは、異なる細胞増殖プラットフォームに直接接続して、低出力量で減容、洗浄、および収穫を行うことにより、さまざまな接着細胞および浮遊細胞の小規模から中規模の処理に簡単に適用できます。
ヒト間葉系幹細胞(hMSC)は、臨床的に関連する細胞の投与量を生成するために重要な、治療の可能性とin vitroで増殖する高い自己複製の可能性を考えると、組織工学と細胞治療の両方における臨床応用の優れた候補です1,2,3。ClinicalTrials.gov によると、現在、さまざまな病状について1,000を超える臨床試験が調査中です4。hMSCの使用への関心の高まりを背景に、近い将来、より多くの臨床試験と市場承認が差し迫っています5,6。ただし、hMSCの製造には、バッチ間のばらつき、リスクの高い原材料の使用、製造には複数のユニット操作、人件費の上昇、スケールアウトまたはスケールアップのコスト、および規制上のハードルが含まれるため、多くのオープンおよび手動プロセスによる汚染に関する懸念に関して、多くの固有の課題があります6,7,8,9,10、11,12。これらの問題は、現在および将来の市場アクセスに対する重大な障壁であり続けています。
クローズドでモジュール式の自動化された製造ソリューションを開発し、リスクの低い補助試薬を使用することで、これらの課題に対処できます。これにより、一貫した製品品質が確保され、人為的ミスによるバッチ障害の可能性が減少し、人件費が削減され、デジタルバッチ記録管理などの観点から、プロセスの標準化と規制コンプライアンスが向上します8、12、13、14。臨床的に関連する細胞の投与量を取得できるようにするには、自家または同種異系のいずれであっても、上流の細胞増殖と下流の処理を閉じた自動化された方法で含む合理化された製造が不可欠です。
上流のhMSC拡張では、現在採用されている2つの最も一般的な製造方法は、スケールアウト(2D単層)とスケールアップ(3Dマイクロキャリアベースのサスペンションシステム)です15,16,17,18。hMSC拡張のための最も伝統的で広く採用されている方法は、低い生産コストとセットアップの容易さのために、2D単層ベースの培養です19。
培養容器内に積み重ねられた平らな表面トレイで構成される多層フラスコは、hMSC生産のスケールアウトに一般的に利用されます。これらのシステムは、典型的には、1層〜40層の培養容器20 で提供され、バイオセーフティキャビネット内で手動で取り扱われる。細胞の継代および回収中の処理ステップでは、容器全体をピペッティングまたは物理的に傾けて、増殖培地、解離試薬、および洗浄バッファーを手動で分注およびデカントします。さらに、複数のユニットを扱うことは、そのサイズと重量のために困難で時間がかかります。
続いて、多層フラスコからのポストハーベスト、培地交換のための遠心分離、細胞洗浄、および体積減少は、細胞製造ワークフロー21全体にわたって不可欠なステップである。従来のベンチトップ遠心分離は、バイオセーフティキャビネット内のキャップ付きチューブまたはボトルへの細胞懸濁液の移し替え、細胞のスピンダウン、上清の手動吸引、バッファーによる細胞の再懸濁、細胞洗浄の繰り返しなど、多数のステップを含む、ほとんどオープンで手動のプロセスです。これにより、キャップの開閉による汚染のリスクと、手動吸引/ピペッティングプロセス中にセルペレットを失う可能性の両方が劇的に増加します22。hMSCなどの接着性細胞用の多層培養システムを扱う場合、オペレーターは遠心分離機とバイオセーフティキャビネットの間を繰り返し行き来し、同時に重いユニットを扱うという骨の折れるプロセスを経る必要があります。これらの手動ステップは面倒であり、人為的ミスや汚染の面でリスクをもたらし、コストがかかるクラスBのクリーンルーム環境で実施する必要があります23。さらに、従来の手動遠心分離プロセスはスケーラブルではなく、細胞のせん断やストレスを引き起こす可能性があります。したがって、細胞回収率、生存率、および残留不純物のウォッシュアウト効率を最大化することは、他の主要な課題22である。細胞治療の商用cGMPスケール製造には、汚染のリスクを低減し、一貫した製品品質を確保し、人件費と生産コストを削減し、プロセスの信頼性を高めるために、閉じたモジュール式の自動化ソリューションが必要です24,25。多層フラスコは、滅菌ガス交換を容易にするためにポートの1つに滅菌0.2μmフィルターを備え、2番目のポートをコネクタを介して無菌的に接続するか、細胞収穫用の自動細胞処理装置に直接チューブ溶接することで、クローズドシステムとして取り扱うことができます。私たちは、細胞、遺伝子、または組織ベースの製品の製造を目的とした革新的なクローズドカウンターフロー遠心分離機を評価することにより、WJ-hMSC継代および回収のほとんどのステップの閉鎖と自動化に取り組みました。この向流遠心分離機は、サイズに基づく細胞分離、培地/バッファー交換、濃縮、さまざまな細胞タイプの回収など、さまざまな細胞処理アプリケーションを実行する柔軟性も備えています8、26、27、28。この装置は、チューブ溶接または無菌コネクタを使用して滅菌接続してバッグを移送したり、選択した拡張プラットフォームに直接接続したりできるクローズドシングルユースキットを使用しています。
この研究では、シングルユース向流遠心分離キットと多層フラスコの間の閉じた滅菌接続を可能にするカスタムチューブアセンブリを設計しました。私たちは、WJ-MSCを多層フラスコから酵素的に分離、洗浄、回収するためのプロトコルを最適化しました。採取したWJ-hMSCは、純度(表面マーカー分析)と効力(CFU-F、三系統分化、サイトカイン分泌プロファイル)について特徴付け、最終製品がロット放出の重要な品質属性(CQA)を満たしていることを確認しました。
この研究では、向流遠心分離装置を使用して、hMSC解離を閉じ、半自動化し、ベンチで洗浄および回収する能力を示しました。ワークフロー全体の重要なステップの1つは、カウンターフロー遠心分離システムのプロトコルビルダーで定義されたプリセットプロトコルに従ってチューブが接続されていることを確認することです。セットアップと操作は簡単で、キットの組み立てから細胞回収までの10層フラスコからの約2Lの培養を処理するのにかかった時間は約60分でした。このワークフローの制限ステップの1つは、多層フラスコから向流遠心分離装置に接続されたトランスファーバッグへの流体移送です。高流量シングルユースキットは、最大流量165 mL/minでしか実行できず、40層フラスコなどの処理には困難な場合があります。流体移送のプロセスを迅速化するために、外部の高流量ポンプを使用して、最初にトリプシン処理された内容物をトランスファーバッグに移し、次に向流遠心分離システムを使用してトランスファーバッグから細胞を洗浄/濃縮および回収することができます。さらに、このプロトコルは、4層から10層多層フラスコへの継代細胞にも適用できます。さらに上流では、向流遠心分離システムは、解凍したhMSCの洗浄、およびシードトレインを開始するための多層フラスコへの直接収穫および培地製剤の最適化にも最適化できます。気流遠心分離チャンバ内の流動床を形成するのに必要な最小細胞数は約3000万細胞であり、バッチ当たりの処理に推奨される最大容量は20Lであることに留意すべきである。
現在、カスタムチューブアセンブリをバイオセーフティキャビネット内の多層フラスコに取り付け、コンポーネントのパーツをオートクレーブすることは、cGMP設定では望ましくありません。別の方法として、カスタムガンマ滅菌チューブアセンブリをサプライヤーにアウトソーシングすることもできます。多層フラスコを提供するサプライヤーは、0.2 μmフィルターを含む目的のチューブアセンブリをフラスコに事前取り付けし、衣装全体のガンマ滅菌を行うオプションも提供しています。これにより、多層フラスコと付属チューブが真に閉じられ、クラスCのクリーンルーム設定のベンチでプロセスを完了できるようになります。
向流遠心分離システムを利用するこのプロセスは、多層容器内の接着ベースの培養細胞に限定されず、動的(攪拌タンクまたはウェーブバイオリアクター)および静的(ガス透過性)懸濁液ベースの細胞増殖プラットフォームに適応できます。具体的には、3Dマイクロキャリア培養で増殖したhMSCの場合、マイクロキャリアから解離したhMSCを回収、洗浄、および製剤化するためのプロトコルをカウンターフロー遠心分離システムで最適化できます。
全体として、プロセスの堅牢性と信頼性が向上したトランスレーショナル細胞療法の開発への関心の高まりにより、閉鎖型の自動化された細胞処理プラットフォームが開発されました。これらのシステムは、取り扱い工程の数を減らし、滅菌接続による潜在的な汚染を防ぎ、労力を削減し、クリーンルームスペースの有効利用を高めることによって製造コストを削減するため、不可欠です21。これに沿って、治療法を翻訳するための規制当局の承認を求めている細胞治療製品開発者の多くは、プロセス開発段階の早い段階でプロセスを閉じ、完全自動化または半自動化を実装することの重要性を認識しています14,31,32。
規制に配慮したSFM XF培地を使用し、21 CFR GMP Part 11および国際的な品質ガイドラインに準拠した補助試薬とともに、この半自動化されたプロセスは臨床製造に容易に適しています。我々は、クローズドプロセスの再現性とWJ-MSCの品質の維持を示しました。 多層フラスコで接着性細胞を培養する効率と安全性を向上させることは、hMSC治療分野だけでなく、細胞株バンキングや接着性ウイルス生産の企業にも利益をもたらすでしょう。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、シンガポールのA*STARからのインダストリー・アライメント・ファンド・プレポジショニング(IAF-PP)資金(H18/01/a0/021およびH18/AH/a0/001)からの支援に感謝の意を表したい。
2L PVC transfer bag | TerumoBCT | BB*B200TM | |
Alcian blue solution, pH 2.5 | Merck | 101647 | |
Alizarin-Red Staining Solution | Merck | TMS-008-C | |
APC anti-human CD73 Antibody | Biolegend | 344015 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400121 | |
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | Bio-Rad | ||
Counterflow Centrifugation System | Thermo Fisher Scientific | A47679 | Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System |
Crystal Violet | Sigma-aldrich | C0775 | |
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | A1285601 | no calcium, no magnesium |
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) | Thermo Fisher Scientific | A27940 | |
CTS TrypLE Select Enzyme | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Custom tubing assembly | Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) | N/A | Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet |
Emflon II capsule (0.2um filter) | Pall | KM5V002P2G100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12662029 | Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions |
FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | |
FITC anti-human CD105 Antibody | Biolegend | 323203 | |
FITC anti-human CD45 Antibody | Biolegend | 304005 | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | Biolegend | 328107 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400109 | |
Hi-Flow Single Use Kit | Thermo Fisher Scientific | A46575 | Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min |
Multi-layered systems | Thermo Fisher Scientific | 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) | Nunc Standard Cell Factory Systems |
NucleoCounter NC-3000 | Chemometec | NC-3000 | |
Oil red O staining solution | Merck | 102419 | |
PDGF-BB | Thermo Fisher Scientific | PHG0045 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PerCP anti-human CD34 Antibody | Biolegend | 343519 | |
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400147 | |
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays | Thermo Fisher Scientific | Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A | |
Sample port | Thermo Fisher Scientific | A50111 | Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10070-01 | |
StemPro Chondrocyte Differentiation | Thermo Fisher Scientific | A10071-01 | |
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) | Thermo Fisher Scientific | ME20236L1 | Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x) |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10072-01 | |
T175 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 159910 | |
T75 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
TGFβ1 | Thermo Fisher Scientific | PHG9204 | |
WJ MSCs | PromoCell | (#C12971; Germany) | Human mesenchymal stem cells |
αMEM media | Thermo Fisher Scientific | 12571063 | With nucleosides |