Seguire la dinamica delle varianti strutturali in popolazioni evolute sperimentalmente

Summary

Abbiamo sviluppato un metodo economico per seguire la dinamica allelica del polimorfismo non a singolo nucleotide che può essere facilmente adattata agli archivi congelati dell’evoluzione sperimentale. Una tecnica di tripletta PCR è stata accoppiata con elettroforesi capillare parallela automatizzata per quantificare la frequenza relativa di un allele di inserzione nel corso dell’evoluzione sperimentale.

Abstract

Le varianti strutturali (SV) (cioè delezioni, inserzioni, duplicazioni e inversioni) sono ora note per svolgere un ruolo importante nella variazione fenotipica e, di conseguenza, in processi come la determinazione della malattia o l’adattamento a un nuovo ambiente. Tuttavia, le varianti a singolo nucleotide ricevono molta più attenzione delle SV, probabilmente perché sono più facili da rilevare e i loro effetti fenotipici sono più facili da prevedere. Lo sviluppo di tecnologie di sequenziamento profondo a breve e lunga lettura ha notevolmente migliorato il rilevamento delle SV, ma la quantificazione della loro frequenza dai dati di sequenziamento aggregato (poolseq) è ancora tecnicamente complessa e costosa.

Qui, presentiamo un metodo piuttosto semplice ed economico, che consente ai ricercatori di seguire la dinamica della frequenza dell’allele SV. Come esempio di applicazione, seguiamo la frequenza di inserimento di una sequenza di inserzione (IS) nelle popolazioni sperimentali evolutive di batteri. Questo metodo si basa sulla progettazione di triplette di primer attorno ai bordi delle varianti strutturali, in modo tale che gli ampliconi prodotti dall’amplificazione del wild-type (WT) e degli alleli derivati differiscano in dimensioni di almeno il 5% e che la loro efficienza di amplificazione sia simile. La quantità di ciascun amplicone viene quindi determinata mediante elettroforesi capillare parallela e normalizzata a una curva di calibrazione. Questo metodo può essere facilmente esteso alla quantificazione della frequenza di altre varianti strutturali (delezioni, duplicazioni e inversioni) e agli approcci pool-seq di popolazioni naturali, comprese le popolazioni patogene all’interno dei pazienti.

Introduction

Le varianti strutturali (SV) sono alterazioni della sequenza genomica, che generalmente colpiscono 50 bp o più. Le quattro categorie di SV descritte sono inserimenti di grandi dimensioni, grandi cancellazioni, inversioni e duplicazioni. Fino a poco tempo fa, è stata dedicata maggiore attenzione alle varianti a singolo nucleotide (SNV) che alle varianti strutturali, in termini di effetti fenotipici e del loro ruolo come determinanti genetici della malattia, o del loro contributo all’adattamento. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che è più facile rilevare gli SNV e prevederne gli effetti fenotipici. Tuttavia, le tecnologie di sequenziamento profondo a breve e lunga lettura hanno notevolmente migliorato la rilevazione delle SV, almeno in genomi singoli individuali o clonali¹. Parallelamente, i loro effetti fenotipici sono stati meglio caratterizzati e sono stati documentati molti esempi della loro implicazione come determinanti genetici della malattia umana ^2,3 o dell’adattamento ad un nuovo ambiente⁴.

Le delezioni e le inserzioni, spesso dovute a inserzioni di elementi genetici mobili (MGE), sono molto più dirompenti dei polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) e portano a mutazioni frameshift e modifiche della struttura proteica. Le delezioni e le inserzioni MGE all’interno dei geni provocano quasi sempre l’inattivazione genica, e le inserzioni in regioni non codificanti possono portare alla repressione o all’espressione costitutiva di geni adiacenti quando le sequenze di inserzione (IS) contengono sequenze promotrici o di terminazione⁵. Mentre il knockout di geni essenziali porta a chiari effetti dannosi sulla forma fisica batterica, la perdita di geni non essenziali è vantaggiosa in alcuni casi. Nonostante i loro costi intrinseci, le duplicazioni possono anche essere vantaggiose e partecipare all’adattamento in quanto portano a un cambiamento nel dosaggio genico; Un aumento dell’attività di una proteina specifica può essere vantaggioso a seconda delle condizioni⁶.

Le popolazioni di evoluzione sperimentale microbica sono di solito iniziate con cloni. Questa iniziale assenza di diversità genetica, combinata con la caratteristica dell'”ambiente chiuso” delle provette, porta a un potenziale molto limitato di evoluzione per guadagno genico attraverso il trasferimento genico orizzontale e la ricombinazione. In queste condizioni specifiche, il contributo all’adattamento di delezioni, duplicazioni e inserimento intragenomico di MGE è particolarmente importante; i batteri spesso si adattano attraverso mutazioni con perdita di funzione (principalmente a causa di delezioni o inserzioni di MGE), colpendo geni che non sono utili^{in ambienti artificiali} stabili, spesso ricchi di sostanze nutritive, 7. Nell’esperimento di evoluzione di E. coli più longevo, le inserzioni di IS150 sono particolarmente frequenti tra le popolazioni evolute dopo 50.000 generazioni, con elementi IS che rappresentano il 35% delle mutazioni che raggiungono un’alta frequenza nelle popolazioni che mantengono il loro tasso di mutazione del punto ancestrale⁸.

Gli studi di evoluzione e risequenziamento accoppiano l’evoluzione sperimentale e le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per studiare come i batteri si adattano, a livello fenotipico e genomico, a diverse condizioni ambientali e stress, come diverse fonti di carbonio ed energia, antibiotici e stress osmotico 9,10,11 . Questi studi tipicamente ottengono informazioni genomiche sulle popolazioni evolute o sui cloni solo nel punto finale sperimentale e, in alcuni casi, in un numero di punti temporali intermedi^12,13,14. Questi dati forniscono informazioni sui geni e sui percorsi coinvolti nell’adattamento a un determinato ambiente, ma raramente consentono ai ricercatori di seguire le dinamiche degli alleli emergenti e ampi de novo nel tempo.

Un approccio per seguire queste dinamiche è quello di scegliere un numero limitato di alleli segreganti di interesse (a causa della funzione dei geni che influenzano, perché si muovono in parallelo in popolazioni indipendenti, ecc.) e utilizzare il sequenziamento amplico per quantificare la proporzione allelica, raggruppando molti punti temporali nella stessa sequenza¹⁵. Questo metodo è stato utilizzato con successo per seguire la dinamica di varianti di piccole dimensioni (SNPs o 1 bp indels) in¹⁶ e¹⁷ popolazioni naturali di microbi. Tuttavia, nel caso di indels più grandi o inserimenti MGE, la differenza di dimensioni degli ampliconi induce differenze di efficienza PCR, che distorcono la relazione tra proporzioni leggere e alleliche. In alcuni casi, la differenza di dimensioni tra i due alleli è superiore alla lunghezza classica dell’amplicone. Qui, abbiamo accoppiato una tecnica di tripletta PCR con elettroforesi capillare parallela automatizzata per quantificare la frequenza relativa di un allele di inserzione in base alla discriminazione delle dimensioni. Questo approccio consente lo sfruttamento di punti temporali sperimentali sottoutilizzati per determinare la dinamica di un allele mutante emergente e per seguire la sua frequenza di fissazione o perdita, in modo economicamente vantaggioso. Abbiamo applicato questo metodo per tracciare gli alleli mutS emergenti, mutati attraverso un’inserzione IS10, fornendo al genotipo mutato un fenotipo ipermutatore.

Questo metodo richiede due alleli bersaglio con una differenza di dimensioni del ≥5%. In primo luogo, le triplette di primer sono progettate per produrre frammenti di dimensioni simili, che condividono un primer comune. In secondo luogo, le condizioni di PCR sono ottimizzate e viene prodotta una curva di calibrazione utilizzando miscele di gDNA wild-type (WT) e mutante. Infine, i campioni vengono amplificati mediante PCR e la frequenza relativa di ciascun allele viene quantificata mediante elettroforesi capillare quantitativa parallela.

Protocol

L’impostazione di questo protocollo richiede una conoscenza precisa del punto di inserimento, cancellazione, inversione o duplicazione all’interno della sequenza ancestrale. Queste informazioni sono solitamente ottenute mediante sequenziamento dell’intero genoma (WGS) dei campioni finali o intermedi. Nel seguente protocollo, il principio generale per il caso di una mutazione di inserzione è dato per ogni fase, insieme a un caso rappresentativo in cui viene seguita la frequenza di un’inserzione IS10 nel gene mutS</em…

Representative Results

Utilizzando il DNA estratto da un clone ancestrale e un clone ipermutatore isolato dalla popolazione S2.11 alla generazione 1.000, abbiamo stabilito la curva di calibrazione mostrata in Figura 2. Le proporzioni effettive dei mutanti provenienti da miscele di DNA preparate in laboratorio e misurate dallo strumento di elettroforesi capillare parallela sono state collegate da una relazione lineare di pendenza 1,0706, con un R2 di 0,9705. Inoltre, c’era un buon accordo tra le repliche…

Discussion

Qui, abbiamo proposto un metodo economico che consente di seguire la dinamica degli alleli SV adattativi emergenti nelle popolazioni evolutive sperimentali. Questo metodo combina le classiche tecniche di PCR e l’elettroforesi capillare parallela automatizzata, consentendo di determinare le quantità relative di due alleli. Una volta impostato, consente la quantificazione delle proporzioni alleliche in molti campioni in parallelo, ed è molto meno costoso del WGS. Questo metodo può essere visto come un equivalente del se…

Materials

96 Well Skirted PCR Plate	4titude	4Ti – 0740	PCR
Agarose molecular biology grade	Eurogentec	EP-0010-05	Agarose gel electrophoresis
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems	Agilent		PDF instruction guide
Buffer TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	Agarose gel electrophoresis
Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles	LABELIANS	8175CSR40H	Bacterial culture
Dneasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69506	DNA extraction
Electrophoresis power supply	Amilabo	ST606T	Agarose gel electrophoresis
Fragment Analyzer Automated CE System	Agilent		Parallel capillary electrophoresis
Fragment DNA Ladder	Agilent	DNF-396, range 1-6000bp	Parallel capillary electrophoresis
GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT	Sigma-Aldrich	G1264-1G	Bacterial culture
High Sensitivity diluent marker	Agilent	DNF-373	Parallel capillary electrophoresis
High Sensitivity NGS quantitative analysis kit	Agilent	DNF-474	Parallel capillary electrophoresis
Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder	NEB	N0469S	Agarose gel electrophoresis
LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	Bacterial culture
Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L	PCR
Primers	Eurogentec		PCR
Prosize data analysis software v.4	Agilent	V.4	Parallel capillary electrophoresis
Qubit assays	Invitrogen	MAN0010876	DNA quantification
Qubit dsDNA HS Assay Kit	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	DNA quantification
Thermocycler	Eppendorf	Ep gradients	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		Agarose gel electrophoresis visualisation
Water for injectable preparation	Aguettant	PROAMP	PCR