Denne protokol beskriver dannelsen af selvorganiserende blodkar fra humane pluripotente og inducerede pluripotente stamceller. Disse blodkarnetværk udviser et omfattende og forbundet endotelnetværk omgivet af pericytter, glat muskelaktin og en kontinuerlig kældermembran.
En organoid defineres som et konstrueret multicellulært in vitro-væv , der efterligner dets tilsvarende in vivo-organ , så det kan bruges til at studere definerede aspekter af dette organ i en vævskulturskål. Bredden og anvendelsen af human pluripotent stamcelle (hPSC) -afledt organoidforskning er avanceret betydeligt til at omfatte hjernen, nethinden, tårekanalen, hjerte, lunge, tarm, bugspytkirtel, nyre og blodkar blandt flere andre væv. Udviklingen af metoder til generering af humane mikrokar specifikt har åbnet vejen for modellering af udvikling af menneskelige blodkar og sygdom in vitro og til test og analyse af nye lægemidler eller vævstropisme i virusinfektioner, herunder SARS-CoV-2. Komplekse og langvarige protokoller, der mangler visuel vejledning, hæmmer reproducerbarheden af mange stamcelleafledte organoider. Derudover nødvendiggør den iboende stokasticitet af organoiddannelsesprocesser og selvorganisering generering af optiske protokoller for at fremme forståelsen af erhvervelse og programmering af celleskæbne. Her præsenteres en visuelt guidet protokol til generering af 3D humane blodkarorganoider (BVO’er) konstrueret fra hPSC’er. Ved at præsentere en kontinuerlig kældermembran, vaskulære endotelceller og organiseret artikulation med vægmalericeller udviser BVO’er de funktionelle, morfologiske og molekylære træk ved human mikrovaskulatur. BVO-dannelse initieres gennem samlet dannelse efterfulgt af mesoderm og vaskulær induktion. Vaskulær modning og netværksdannelse initieres og understøttes ved indlejring af aggregater i en 3D-kollagen og opløselig kældermembranmatrix. Menneskelige fartøjsnetværk dannes inden for 2-3 uger og kan dyrkes yderligere i skalerbare kultursystemer. Det er vigtigt, at BVO’er transplanteres til immunkompromitterede mus anastomose med den endogene musecirkulation og specificerer i funktionelle arterier, vener og arterioler. Den nuværende visuelt styrede protokol vil fremme human organoid forskning, især i forhold til blodkar i normal udvikling, vævsvaskularisering og sygdom.
Vaskulær dysfunktion og blodkarsygdomme til stede med markante komplikationer i organfunktioner. Hjerte-kar-sygdomme (CVD) er den største dødsårsag på verdensplan1 og er også den primære medvirkende faktor til stigende sundhedsomkostninger i USA. Antallet af CVD-tilfælde stiger årligt, og et stigende antal af disse tilfælde forekommer i yngre aldersgrupper (20-45 år)2. Flere in vivo-modeller er blevet udviklet til at undersøge udviklingen og modningen af blodkar, vaskulær sygdom og endoteldysfunktion 3,4. I øjeblikket kan metoder, der kombinerer enkelt- og multiple afstamningsdefinerede celler, enten afledt af stamceller eller isoleret fra voksent væv in vivo, skabe vaskulære netværk, der replikerer aspekter af human vaskulær funktion og anatomi 5,6. Blodkar er opstået som et af de første funktionelle systemer under udvikling fra mesodermen, og de organiserer enten gennem en samlingsproces kaldet “vaskulogenese” eller ved udvidelse og forgrening fra allerede eksisterende kar, der kaldes “angiogenese”7.
Ved at udnytte kraften i udviklingsbiologi og selvstyret samling rapporterede Wimmer et al. de første selvorganiserende 3D-humane blodkarorganoider fra hPSC’er, der udviser de funktionelle, morfologiske og molekylære egenskaber ved human mikrovaskulatur8. I lighed med human vaskulatur9 genereres disse hBVOs og er til stede med et endotel, en kontinuerlig kældermembran og omgivende vægmalerier 8,10. HBVOerne kan transplanteres in vivo og anastomoseres med den endogene cirkulation. De kan også gennemgå modning in vitro og tjene som modeller for hjerte-kar-sygdomme (dvs. diabetes)8 eller vævstropisme i virusinfektioner såsom SARS-CoV-211. Mens vi tidligere offentliggjorde en skriftlig protokol10, findes der ingen tilgængelig videoprotokol for denne ellers komplekse teknik.
Gennem en kortfattet trinvis progression opnås hBVO-dannelse gennem aggregeret dannelse, mesoderminduktion ved anvendelse af en WNT-agonist, Chiron (CHIR99021) og knoglemorfogent protein – 4 (BMP4)12,13, vaskulær induktion via vaskulær endotelvækstfaktor A (VEGFA) og Forskolin (Fors)12 og indlejring i en brugerdefineret spirematrix 8,10. Vaskulær modning og netværksdannelse følger indlejringen af aggregaterne i spirematrixen. Disse menneskelige fartøjsnetværk dannes inden for 2-3 uger og kan fjernes fra spirematrixen og dyrkes yderligere i skalerbare kultursystemer i op til 6 måneder. Her tilvejebringes optisk styrede procedurer til dannelse og anvendelse af human stamcelleafledt vaskulatur.
Nylige gennembrud i stamcelleafledte organoidkulturer har skabt rammerne for mere avancerede og fysiologisk relevante modeller af menneskelig vaskulatur. Den humane blodkarorganoid (hBVO) model, der præsenteres her, udviklet i vores laboratorium 8,10, giver et kraftfuldt middel til at udforske ikke kun yderligere aspekter af human vaskulogenese, men også nye veje til sygdomsmodellering og regenerativ terapi 8,10,11. Flere in vivo-modeller er blevet anvendt til at undersøge udvikling og modning af blodkar, vaskulær sygdom og endoteldysfunktion 3,4. Forskellige tilgange kombinerer enkelt- og multiple afstamningsdefinerede celler, der enten stammer fra stamceller eller isoleres fra voksent væv in vivo, for at skabe replikative humane vaskulære netværk 5,6. Protokollen, der præsenteres her, udnytter princippet om udviklingsbiologi og selvorganisering til at give de første multicellede afstamning humane blodkarnetværk, der i det væsentlige kan genereres fra en enkelt hPSC 8,10.
Hver stamcellelinje har en unik genetisk sammensætning og adskiller sig fra andre med hensyn til dens sourcing, funktion og lydhørhed15. Derfor blev protokollen for humane blodkarorganoider (hBVO’er) udviklet og optimeret for at sikre en robust og reproducerbar protokolkompatibilitet med flere (>12) forskellige hPSC-linjer 8,10. Metoden beskrevet her genererer hPSC-afledte blodkarorganoider over 2 uger. Ændringer i mediesammensætningen og/eller teknikkerne i hBVO generering kan imidlertid føre til ineffektivt fartøjsnetværk og organoid generering. De varierende spredningshastigheder for individuelle stamcellelinjer påvirker også markant reproducerbarheden af stamcelleforsøg15 og dermed organoidkulturer. For eksempel er der ved generering af BVO’erne mere proliferative celler eller et højere antal store dag 1-aggregater i sagens natur underlagt forskellige metaboliske miljøer og gas- og næringsdiffusionsparametre. Dette ændrer igen vækstfaktoreksponeringstiderne og effektiviteten, graden af differentiering og vaskulær priming og vigtigst af alt evnen til at danne fartøjsnetværk ved indlejring af aggregaterne i kollagen 1 og opløselig kældermembranmatrix.
Den passive diffusion af ilt og administrationen af essentielle næringsstoffer fra et eksternt miljø er ikke ideel til langsigtet cellevækst af 3D-organoider og vævsmorfogenese in vitro16. Selv om det afhænger af flere faktorer (dvs. vævets stofskifte, biotilgængeligheden af næringsstoffer og gasser, et statisk eller dynamisk miljø), er der fastsat en generel grænse på 150 μmO2 og næringsstofdiffusion for væv, der dyrkes in vitro, idet humant væv fysiologisk set har strenge af levende celler inden for 150 μm fra perfunderede blodkar17. Selvom effektive gas- og næringsdiffusionsafstande på 70-200 μm også er blevet foreslået18,19,20,21, påvirker konstruktionstætheden, temperaturen, pH og mediesammensætningen diffusionseffektiviteten betydeligt. På grund af overfladearealoptimering og integrin-beta-receptorkommunikation efter dag 6-indlejring fungerer aggregater med en diameter på 250-300 μm bedre end dem > 500-600 μm i diameter, hvilket resulterer i en komplet beholderspiringsproces og en minimalt kondenseret organoid kerne. Således er den samlede størrelse afgørende og kan påvirkes af både antallet af celler, der anvendes under den indledende såning, og den tid, der er afsat til aggregatdannelse. Mikrobrøndplader, der giver mulighed for kontrol over aggregatstørrelsen og antallet22, er et levedygtigt alternativ til den ellers stokastiske aggregatdannelsesteknik, der er resultatet af brugen af 6-brøndsplader med ultralav fastgørelse i denne protokol. Konsistens i timing og styring af aggregatstørrelserne i løbet af de første 6 dage af hBVO-protokollen er en af, hvis ikke den mest, afgørende indikatorer for vellykket udvikling af bona fide blodkarorganoider.
Middelskift på dag 1 (mesoderm induktion) og dag 4 (vaskulær induktion) skal fuldføres i kombination med sedimentering af aggregaterne. Selvom centrifugering er et fristende alternativ, kan de ekstra kræfter, der påføres de svagt monterede aggerater, forårsage uønsket klumpning, samling og klipning, hvilket negativt påvirker differentiering, modning og spiringseffektivitet i de senere stadier af protokollen. Arbejde på is i løbet af dag 6-indlejringsprocessen er afgørende for at bevare korrekt ECM-polymerisering og lagdannelse. Under induktionen af den samlede indlejring og spiring vil udsættelse af ECM for temperaturer over 4 °C og/eller en anden ECM-pH-værdi end 7,4 ikke kun påvirke polymerisationshastighederne og ECM-lagintegriteten, men også spireeffektiviteten af de indlejrede aggregater. ECM-spirematrixens elastiske natur muliggør nem løsrivelse og transport fra 12-brønds kulturskålen til den sterile skæreflade. Individuelle organoider fjernet fra matrixen og overført til 96-brøndplader med ultralav vedhæftning vil forbruge de resterende omgivende ECM og bevare selvorganiserede vægmalericellebelagte endotelmikrokarnetværk med en kontinuerlig kældermembran.
Selvom det ikke er dækket af dette forslag, kan ændringer i mediesammensætningerne replikere sygdomme, der igen fremkalder patologiske reaktioner i hBVOs 8,11. Grænserne for sygdomsmodellering ved hjælp af hBVO-systemet er langt fra velkendte, og dette er bestemt et område, der skal udforskes. Anvendelsen af vores blodkarorganoidteknologi i vaskulariseringen af tidligere avaskulære organoidkonstruktioner23 er også af betydelig indflydelse og interesse.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle medlemmer af vores laboratorier for kritiske input og diskussioner. JMP modtog finansiering fra T. von Zastrow-fonden, FWF Wittgenstein-prisen (Z 271-B19), det østrigske videnskabsakademi, fællesforetagendet for initiativet om innovative lægemidler 2 (JU) under tilskudsaftale nr. 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program og Canada 150 Research Chairs Program F18-01336 samt Canadian Institutes of Health Research COVID-19-tilskud F20-02343 og F20-02015.
1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
Cellulose wipes | |||
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
Coverslips (22 x 50 mm) | |||
Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
Fine forceps | FST | 11254-20 | |
Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | |
Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 |