Erforschung der Zwei-Kräuter-Kombinationsstrategie zur Behandlung verletzter PC12-Zellen
Summary
Dieses Protokoll bietet eine Kombinationsstrategie von zwei Kräutern zur Behandlung verletzter PC12-Zellen. Das Protokoll bietet eine Referenz für die Optimierung der besten Applikationsweise der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM).
Abstract
Im Hinblick auf die Vorteile der Kombination der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) bei der Behandlung der zerebralen Ischämie untersuchten wir die Unterschiede in der Wirksamkeit und dem Mechanismus zwischen der Präparatkombination und der Komponentenkombination, um die Zwei-Kräuter-Kombinationsstrategie zur Behandlung verletzter PC12-Zellen zu untersuchen. Kobaltchlorid (CoCl2) in Kombination mit einem glukosefreien Medium wurde verwendet, um eine oxidative Schädigung von PC12-Zellen zu induzieren. Anschließend wurde die optimale Kombination aus Astragalus mongholicus (Ast) und Erigeron breviscapus (Eri ) ausgewählt und nach einheitlichen Designmethoden kombiniert, nachdem ihre sichere und wirksame Konzentration auf PC12-Zellen überprüft worden war. Ferner umfasst die gescreente Komponentenkombination 10 μM Astragalosid A, 40 μM Scutellarin und 75 μM Chlorogensäure in zwei Kräutern. Dann wurden MTT, Annexin V-FITC/PI, Immunfluoreszenz und Western-Blot-Analyse verwendet, um die Wirksamkeit und den Mechanismus der Präparatekombination und der Komponentenkombination auf verletzten PC12-Zellen zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass die optimale Präparationskombination für das Zellüberleben eine Ast-Injektion und eine Eri-Kapsel mit einer Konzentration von 6:1,8 (μM) war. Die Komponentenkombination (10 μM Astragalosid A, 40 μM Scutellarin und 75 μM Chlorogensäure) war wirksamer als die Zubereitungskombination. Beide Kombinationen reduzierten die apoptotische Rate, die Fluoreszenzintensität von Caspase-3 und den Gehalt an intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erheblich. In der Zwischenzeit regulierten sie die Expressionsniveaus von p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax und Nrf2 hoch. Diese Effekte waren in der Komponentenkombination deutlicher. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass beide Kombinationen die durch CoCl2 in Kombination mit einem glukosefreien Medium auf PC12-Zellen induzierte Schädigung hemmen und so das Zellüberleben fördern können. Die Effizienz der Komponentenkombination gegenüber der Präparationskombination kann jedoch auf eine stärkere Regulation des PI3K/Akt/Nrf2-Signalwegs zurückzuführen sein, der mit oxidativem Stress und Apoptose zusammenhängt.
Introduction
Chronische zerebrale Ischämie, verursacht durch zerebrale Hypoperfusion, ist eine häufige Erkrankung bei Menschen mittleren Alters und älteren Menschen1. Als langfristige okkulte Ischämie kann es zu einer fortschreitenden oder anhaltenden neurologischen Dysfunktion kommen. Zu den wichtigsten pathologischen Mechanismen gehören Zellapoptose und oxidative Schäden, die zu einer fortschreitenden oder anhaltenden neurologischen Dysfunktion führen. Dies ist die pathologische Grundlage der Alzheimer-Krankheit, der vaskulären Demenz und anderer Krankheiten und beeinträchtigt die Lebensqualität der Patienten erheblich. In der modernen Medizin mangelt es jedoch immer noch an idealen Medikamenten zur Behandlung der chronischen zerebralen Ischämie2. Gleichzeitig ist die Kombination von Astragalus mongholicus (Ast) und Erigeron breviscapus (Eri ) in der klinischen Praxis der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) weit verbreitet4. Die Kombinationsstrategie hat sich bemerkenswert verbessert, um die Wiederherstellung der Nervenfunktion nach zerebraler Ischämie zu fördern, die besser ist als die eines einzelnen Medikaments. Es gibt jedoch große Unterschiede im Dosierungsverhältnis in der Kombination der beiden Medikamente4. Die wirksamen Komponenten und der Wirkmechanismus sind nicht genau definiert, was das Hauptproblem ist, das die klinische Anwendung einschränkt.
Frühere Studien haben die synergistische Wirkung der Präparationskombination aus Ast-Injektion und Eri-Injektion bei der Behandlung von zerebraler Ischämie bei Ratten gezeigt. Es kann die Expression des p-Akt-Proteins hochregulieren und die Expression des Bcl-2-assoziierten Todespromotors (BAD)-Proteins5,6 herunterregulieren, das zu den Proteinen der B-Lymphoblastom-2-Familie (Bcl-2) gehört und die Apoptose fördert. Die materielle Grundlage und der Mechanismus seiner synergistischen Wirkung sind jedoch nicht klar. Darüber hinaus wurde das Verletzungsmodell von PC12-Zellen mit CoCl2-kombiniertem glukosefreiem Medium erstellt, und die optimale Komponentenkombination in Ast und Eri wurde gescreent und definiert7.
In dieser Studie werden die wirksamen Dosen von Ast und Eri unter Verwendung des verletzten PC12-Zellmodells untersucht. Die optimale Kombination der beiden Wirkstoffe wird mit diesem Modell in Kombination mit der homogenen Designmethode gescreent. Das Zellmodell wird verwendet, um den Unterschied in den Wirkungen und Mechanismen der Präparationskombination und der Komponentenkombination in verletzten PC12-Zellen weiter zu bewerten. Diese Strategie zielt darauf ab, die Schutzwirkung und den Regulationsmechanismus der beiden Arten von Kombinationen auf verletzte PC12-Zellen durch den PI3K/Akt/Nrf2-Signalweg zu untersuchen, um den besten Kombinationsmodus zu bestimmen. Diese Studie liefert eine Referenz für die Optimierung der besten Applikationsweise der TCM.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der modernen klinischen Praxis mangelt es immer noch an idealen Medikamenten zur Behandlung der zerebralen Ischämie2. Unter der Leitung der Ergänzung des Qi und der Aktivierung der Durchblutungsmethode wurden Ast, Eri und andere Präparate in Kombination in der klinischen Praxis der TCM verwendet und haben gute umfassende Vorteile erzielt13,14,15. Eine große Anzahl von Studien hat gezeigt, dass Ast …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch wichtige Forschungs- und Entwicklungsprojekte des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie der Provinz Sichuan finanziert (2020YFS0325).
Materials
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | – | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | – | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
- Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
- Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
- Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
- Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
- Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
- . Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 (2020)
- . Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 (2020)
- Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
- Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
- Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
- Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
- Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
- Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
- Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
- Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
- Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
- El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
- Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
- Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
- Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer’s disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
- Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
- Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
- Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).
