Dit artikel presenteert twee methoden op basis van fluorescentie in situ hybridisatie om het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen te bepalen de niet-geënt en geënt ovariumschorsweefsel van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen.
Miljoenen mensen wereldwijd hebben te maken met problemen met betrekking tot vruchtbaarheid. Verminderde vruchtbaarheid, of zelfs onvruchtbaarheid, kan te wijten zijn aan veel verschillende oorzaken, waaronder genetische aandoeningen, waarvan chromosomale afwijkingen de meest voorkomende zijn. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een bekende en veelgebruikte methode om chromosomale afwijkingen bij de mens op te sporen. FISH wordt voornamelijk gebruikt voor de analyse van chromosomale afwijkingen in de spermatozoa van mannen met numerieke of structurele chromosomale afwijkingen. Bovendien wordt deze techniek ook vaak toegepast bij vrouwen om X-chromosomale afwijkingen te detecteren waarvan bekend is dat ze ovariële dysgenese veroorzaken. Informatie over het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen van vrouwtjes met X-chromosomale afwijkingen in lymfocyten en/of buccale cellen ontbreekt echter nog.
Het doel van deze studie is om fundamenteel onderzoek met betrekking tot X-chromosomale afwijkingen bij vrouwen te bevorderen, door twee methoden op basis van FISH te presenteren om het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen te identificeren. Eerst wordt een methode beschreven om het X-chromosomale gehalte van geïsoleerde eierstokcellen (eicellen, granulosacellen en stromale cellen) te bepalen in niet-geënt ovariële cortexweefsel van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen. De tweede methode is gericht op het evalueren van het effect van chromosomale afwijkingen op folliculogenese door het bepalen van het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen van nieuw gevormde secundaire en antrale follikels in eierstokweefsel, van vrouwtjes met X-chromosomale afwijkingen na langdurige transplantatie in immuungecompromitteerde muizen. Beide methoden kunnen nuttig zijn in toekomstig onderzoek om inzicht te krijgen in het voortplantingspotentieel van vrouwtjes met X-chromosomale afwijkingen.
Onvruchtbaarheid is een gezondheidsprobleem van het mannelijke of vrouwelijke voortplantingssysteem, dat wereldwijd ongeveer 186 miljoen personen in de vruchtbare leeftijd treft1. Bij ten minste 35% van de onvruchtbare paren wordt onvruchtbaarheid veroorzaakt door een aandoening van het vrouwelijke voortplantingssysteem2. Er zijn veel factoren die vrouwelijke onvruchtbaarheid kunnen veroorzaken, zoals genetische factoren, afwijkingen van het genitale kanaal, endocriene disfunctie, ontstekingsziekten en iatrogene behandeling3.
Genetische afwijkingen zijn aanwezig bij ongeveer 10% van de onvruchtbare vrouwen 4,5. Van alle genetische afwijkingen zijn X-chromosoomafwijkingen de meest voorkomende oorzaak van ovariële dysgenese2. Verschillende studies hebben gemeld dat X-chromosomale afwijkingen bij vrouwen met het syndroom van Turner (TS) of het Triple X-syndroom geassocieerd zijn met voortijdig ovarieel falen als gevolg van een versneld verlies van geslachtscellen of verminderde oogenese 6,7,8.
Afwijkingen van het X-chromosoom zijn onder te verdelen in: 1) numerieke aberraties, waarbij het aantal X-chromosomen verschillend is maar de X-chromosomen intact zijn; en 2) structurele afwijkingen, waarbij het X-chromosoom genetisch materiaal heeft gewonnen of verloren 3,9. Numerieke afwijkingen van het X-chromosoom komen vaker voor dan structurele afwijkingen en worden vaak veroorzaakt door spontane fouten tijdens celdeling 3,9. Wanneer een dergelijke fout optreedt tijdens meiose, kan dit leiden tot aneuploïde gameten en uiteindelijk tot nakomelingen met chromosomale afwijkingen in alle cellen. Wanneer chromosoomdefecten optreden in somatische cellen als gevolg van fouten die optreden tijdens mitose in de vroege stadia van ontogenese, kan dit leiden tot mozaïcisme. Bij deze personen zijn zowel cellen met een normaal X-chromosomale inhoud als cellen met X-chromosomale afwijkingen aanwezig.
In de jaren 1980 werd een cytogenetische techniek genaamd fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) ontwikkeld om specifieke nucleïnezuursequenties op metafase- en interfasechromosomen10,11 te visualiseren en te lokaliseren. Deze techniek maakt gebruik van fluorescerend gelabelde DNA-sondes om te binden aan een specifieke sequentie in het chromosoom, die vervolgens kan worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Tegenwoordig wordt FISH veel gebruikt als een klinisch diagnostisch hulpmiddel en wordt het beschouwd als de gouden standaard bij het detecteren van chromosomale afwijkingen10. Op het gebied van reproductieve geneeskunde is FISH-analyse op sperma gebruikt om inzicht te krijgen in het X-chromosomale gehalte van spermatozoa bij mannen met numerieke of structurele chromosomale afwijkingen in somatische cellen12,13,14. Deze studies toonden aan dat mannen met chromosomale afwijkingen meer kans hadden op een hogere frequentie van aneuploïde spermatozoa in hun sperma in vergelijking met mannen met normale karyotypen12,13,14.
In tegenstelling tot spermatozoa is er zeer weinig bekend over het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen (inclusief eicellen, granulosa / theca-cellen en stromale cellen) bij personen met een chromosomale aberratie, evenals de mogelijke gevolgen van aneuploïdie van deze cellen op hun voortplantingspotentieel. Een belangrijke reden voor de schaarse informatie over het karyotype van eierstokcellen in vergelijking met spermatozoa is het feit dat vrouwen een invasieve procedure moeten ondergaan, zoals een follikelpunctie of een operatie om eicellen of ovariële cortexweefsel te verkrijgen. Vrouwelijke gameten zijn daarom moeilijk te verkrijgen voor onderzoeksdoeleinden.
Momenteel wordt in Nederland een observationele interventiestudie uitgevoerd om de werkzaamheid van cryopreservatie van eierstokweefsel bij jonge vrouwen met TS15 te onderzoeken. Eén fragment van het ovariële cortexweefsel van de patiënt was beschikbaar om de X-chromosomale inhoud van de eierstokcellen te identificeren16,17. Als onderdeel van de studie werd een nieuwe methode ontwikkeld op basis van FISH van gedissocieerd ovariële cortexweefsel om te bepalen of chromosomale afwijkingen aanwezig zijn in eierstokcellen bij vrouwen met een chromosomale afwijking in niet-ovariële somatische cellen, zoals lymfocyten of buccale cellen. Daarnaast werd ook het effect van aneuploïdie in eierstokcellen op folliculogenese bepaald. Hiertoe werd een gevestigd FISH-protocol gewijzigd dat de analyse van histologische secties van ovariële cortexweefsel mogelijk maakt na kunstmatig geïnduceerde folliculogenese tijdens langdurige xenotransplantatie bij immuungecompromitteerde muizen. In deze studie presenteren we twee methoden op basis van FISH om het X-chromosomale gehalte in eierstokcellen in niet-geënt en geënt ovariële cortexweefsel bij vrouwen met X-chromosomale afwijkingen te bepalen, met als doel de basiswetenschap over dit onderwerp te verbeteren.
FISH-analyse is een bekende techniek om X-chromosomale afwijkingen in lymfocyten of buccale cellen van zowel mannen als vrouwen te detecteren10. Verschillende studies hebben FISH beschreven op gameten van mannen met X-chromosomale afwijkingen, maar gedetailleerde informatie verkregen door FISH over eierstokcellen van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen ontbreekt nogsteeds 14. Dit artikel presenteert nieuwe methoden op basis van FISH om te bepalen of aneuploïdie aanwezig…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef en Milan Intezar voor hun expertise en technische assistentie. Financieringsbronnen: Merck Serono (A16-1395), Goodlife en Ferring.
Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
Collagenase I | Sigma | 131470 | |
Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
DAPI | Vector | H-1200 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
EDTA | Merck | 108421 | |
Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
Glucose | Merck | 108337 | |
Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
Hybridization Station | Dako | S2451 | |
Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
L15 | Lonza | 12-700Q | |
Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
Light microscope | Zeiss West Germany | ||
Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
Trypsin | Sigma | T4799 | |
Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
Xylene | BOOM | 760518191000 |