Rを用いた聴覚脳幹応答波形のピーク振幅と潜時の半自動解析

Summary

この記事では、聴覚脳幹応答波形の最初の5つのピークと谷の振幅と遅延の半自動測定について説明します。追加のルーチンは、実験者分析のためにデータをコンパイルしてスプレッドシートに注釈を付けます。これらの無料のコンピュータルーチンは、オープンソースの統計パッケージRを使用して実行されます。

Abstract

過去15年間の多くの報告では、騒音曝露などの侮辱後の聴脳幹反応(ABR)波形の変化を評価しています。一般的な変化には、ピーク1の振幅の減少と後のピークの相対的な待ち時間の減少、およびピーク1の振幅と比較した後のピークの振幅の相対的な増加に反映される中心ゲインの増加が含まれます。多くの実験者は、ピークと谷を視覚的に特定して相対的な高さと待ち時間を評価しますが、これは、各周波数と条件の聴力範囲全体で波形を5dB刻みで収集する場合、面倒なプロセスです。このホワイトペーパーでは、RStudioインターフェイスを備えたオープンソースプラットフォームRで実行して、聴覚脳幹応答(ABR)波形のピークと谷の測定を半自動化できる無料のルーチンについて説明します。ルーチンは、ピークとトラフの振幅と遅延を識別し、検査用に生成された波形にこれらを表示し、統計分析のために結果をスプレッドシートに照合して注釈を付け、図の平均波形を生成します。自動プロセスがABR波形を誤って識別した場合、補正を支援する追加のツールがあります。目標は、ABR波形の解析に必要な時間と労力を削減し、将来より多くの研究者がこれらの分析を含めることです。

Introduction

聴覚脳幹反応(ABR)は、動物被験者およびヒト乳児の聴力閾値を決定するために頻繁に使用されます。ABRは、聴覚刺激に対する神経系の最初の反応の脳波(EEG)記録であるため、蝸牛螺旋神経節ニューロンの協調発火と、両側処理を含む聴覚脳幹における初期の信号処理を反映する追加情報を運びます¹。これらの反応は、騒音外傷の影響を受ける可能性があります。例えば、マウスにおいて一時的な閾値シフトを誘発するのに十分なノイズ曝露もまた、ABRピーク1²の振幅を永久に減少させることができる。さらに、そのような外傷は、おそらく抑制性調節⁴の喪失に起因して、ピーク間潜時を減少させ、後のピーク³の相対振幅を増加させる可能性がある。これらの所見に加えて、特定の遺伝子変異は、外傷がない場合にABR波形を変化させることが示されている^5,6,7。したがって、ABR波形のルーチン分析は、実験モデルにおける聴覚系への洞察を提供することができます。

また、ABR波形を患者の診断ツールとして使用することにも関心が寄せられています。以前の報告では、ABRピーク1が騒音曝露後のヒト患者または耳鳴り患者で減少するかどうかを評価しています^8,9。特に、片頭痛発作は、数週間の間ピーク潜時を一時的に増加させ、その後、影響を受けた個人ではABR波形が正常に戻ることが報告されています¹⁰。COVID-19は、ABRピーク間の潜伏時間の長期的な変化を引き起こすと報告されています^11,12、別の研究では異なる結果が報告されています¹³。難聴は加齢に伴う認知症と併存することが多く、難聴が大きい人は認知症を経験する傾向があり、より急速に進行する傾向があります¹⁴。研究者らは、パーキンソン病(Jafari et al.15でレビュー)やアルツハイマー病(Swordsら^でレビュー)などの神経変性疾患、および通常の老化¹⁷におけるABR波形の変化を調査しました。より多くの研究者や臨床医が老化の一般的な病気のバイオマーカーとして感覚障害を調査するにつれて、ABRなどの技術はヘルスケアで日常的になる可能性があります。

文献のメソッドセクションを調べると、ラボはABR波形を分析するためのカスタムスクリプトをMatLabで作成することが多いことがわかります。インテリジェント・ヒアリング・システムズのABRプラットフォームには波形解析機能がありますが、オペレーターが手動で山と谷を選択する必要があります。ここでは、オープンソースで自由に利用できる統計環境 R と RStudio インターフェイス用の半自動分析ルーチンを作成しました。本報告では、ルーチンを用いて得られたデータと、実験者に手動でピークと谷を同定して得られたデータを比較し、2つの方法のデータが強く相関していることを示している。重要なことに、ルーチンには盲検化機能が組み込まれており、サンプルのメタデータは最後まで組み込まれない別のファイルに配置されます。これらの機能により、私たちのラボの波形解析が合理化されました。

Protocol

動物に対して行われるすべての手順は、ロチェスター大学動物研究委員会によって事前に承認されました。実験対象は、1ヶ月齢の野生型F1雌マウス12匹とした。これらのF1マウスは、CBA / CaJダムとC57BL / 6J種雄牛を交配させた産物です。マウスは、標準的な12時間の明暗サイクル、無制限の食物と水、および十分な営巣供給を備えたビバリウム施設で飼育および収容されました。5人以下の同性の兄弟が1つのケージに一緒に収容されました。 1. 分析用データの取得 注:このステップは、施設のガイドラインに準拠し、施設の動物福祉委員会によって事前に承認されている必要があります。マウスからABRデータを生成するための詳細なプロセスは、他の場所18に記載されている。 選択したプラットフォームで ABR を記録します。注:ここに示す例では、記録はマウスで実行されました。75 dB の音圧レベルから始まり、5 dB ステップで 5 dB まで減少する 5 ms のクリック刺激を使用します。振幅ごとに平均512回のスイープを記録します。刺激後1.3msから12.5msの間の任意のインスタンスで、ピークからトラフまでの振幅が31μVを超える場合は、応答を拒否します。注:トーンピッププレゼンテーションからの録音も使用できます。この分析ルーチンは、人間を含む他の種でも機能すると予想されます。 ABR 記録を ASCII ファイルとしてエクスポートします。IHSの場合は、コンピュータープログラムを開きます。 目的のファイルをロードし、目的の波形を1ページに表示します。 [ データ ] タブで、[ ページを ASCII として保存 ] を選択して.txt ファイルを取得します。 データ ファイルに適切な名前を付けた後 (“ID”) は、 ID とサブジェクト情報を “info.csv” というメタデータ ファイルに記録します。「ID」に遺伝子型、性別、年齢、治療などの情報が含まれていないことを確認してください。この情報は、代わりに “情報.csv” に記録されます注:トランプの公正なデッキを使用して、必要に応じてラベルをランダムに割り当てることができます。 分析するすべてのファイルを個別の「ID」ファイルとして繰り返します。 2.必要なパッケージをインストールし、動作中のコンピューターにデータをロードします R (https://www.r-project.org) と RStudio (https://www.rstudio.com) をダウンロードしてインストールします。注 : ここで説明するプロトコルでは、R ≥ 4.0.0 が使用されていました。 必要なライブラリ ( tidyverse、 shiny、 plotly、 zoo) をインストールするには、RStudio のコマンド ウィンドウで次のコマンドを入力します。Install.packages(“tidyverse”)Install.packages(“shiny”)Install.packages(“plotly”)Install.packages(“zoo”) スクリプト FindPeaks.R および See_trace_click をダウンロードします 。ホワイト ラボのGitHub(https://github.com/PWhiteLab/FindPeaks)および関連ファイル「Time.csv」のR。 すべての ASCII ファイル、”info.csv”、および “Time.csv” を格納する新しいフォルダを作成します。この例では、フォルダーに “Test_Folder” という名前を付けます。「Test_Folder」内で、ASCIIファイルを「ASCII_Folder」というタイトルのサブフォルダに配置します。 3. FindPeaks.Rによる予備分析の取得 RStudio で FindPeaks.R スクリプトを開きます。 ツールバーの スクリプト のタブを右クリックして作業 ディレクトリの設定を選択し、 Test_Folder に設定します( 補足図S1Aを参照)。 スクリプトウィンドウで、ツールバーの右上にある [ソース] をクリックしてプログラムをロードします (補足図 S1B を参照)。 コマンドウィンドウで、次のコマンドを使用して波形を分析します( 補足図S2を参照)。個々のファイルの場合はFindPeaks_single(“ASCII_folder/ID.txt”) (補足図S2Aを参照)バッチ処理用のFindPeaks_group(“ASCII_Folder”) (補足図 S2B を参照)注:スクリプトは、(1)ラベルの付いたピークとトラフを含む波形を表示するpdfファイル( 補足図S2Cを参照)と(2)振幅(μV)と遅延(ms)の数値データを含むID.csvファイルを出力します。両方のファイルは「Test_Folder」に配置されます。 4. 予備分析の検証 注:低騒音レベルでは、波形の一部がノイズと区別しにくくなり、FindPeaks.Rが実験者の意見と比較してピークまたは谷を誤認する可能性があります。不一致がある場合は、スクリプトSee_trace_click.Rから取得したデータで.csvファイルを修正できます。 コマンドを使用して、特定の個人の波形データをロードします( 補足図S3Aを参照)。波形<- ASCII_extract("ASCII_Folder/ID.txt") See_trace_clickを開きます。RStudio の R スクリプト。 左側のヘッダーで、[ Run App] ボタンをクリックし、新しいインタラクティブ (光沢のある) ウィンドウが表示されるのを待ちます ( 補足図 S3B を参照)。 左上のボックスに、修正が必要な波形のサウンドレベルを入力し、ウィンドウに表示されている波形を探します。 波形の周りでカーソルを動かすと、任意のポイントでのレイテンシと振幅が表示されます。 正しいピークと次のトラフをクリックして、下の表にデータを記録します。遅延データをコピーして.csvファイルに貼り付けます(補足図S3Cを参照)。 振幅測定値を計算するには、 スプレッドシートセルのピーク振幅から次のトラフ振幅を減算します。 5. データセットのコンパイルと可視化 検証済みの.csvファイルを「Peak_Data」というタイトルのTest_Folderの新しいサブフォルダーに転送します。 データを 1 つの .csv ファイルに追加し、”Peak_Data.csv” という名前を付けます。 次のコマンドを使用します。コンパイル (“Peak_Data”)注: このスクリプトは、info.csv のメタデータと Peak_Data.csv を組み合わせて、グループにグループ情報でラベルを付けます。また、ピーク間のレイテンシと振幅比を自動的に計算します。 コンパイルされたデータに対して統計分析を実行します。シャピロ-ウィルクス検定などの正規性の検定を使用して、次の関数でデータの分布を評価します。shapiro.test() シャピロ・ウィルクス検定が有意でない場合、データセットは正規分布を持ちます。したがって、次の関数を持つANOVAなどのパラメトリック検定でデータを評価します。aov() Shapiro-Wilks検定が p = 0.05未満の場合は、クラスカル-ウォリス順位和検定(以下の関数を使用)または別の適切なノンパラメトリック測度を使用します(ディスカッションの他の可能性を参照)。kruskal.test() 平均波形を表示するには、次のコマンドを使用します。Average_Waveform(“ASCII_Folder”, aes(x = Data_Pnt_ms, y = “dB”, グループ = 遺伝子型, 色 = 遺伝子型))注:このコマンドは、さまざまな遺伝子型の平均波形をさまざまな色で表示します。y 変数 dB には、 目的の振幅に対応する数値 (75 など) を引用符なしで挿入します。その他の比較には、メタデータの対応する グループ ラベル を使用します。

Representative Results

クリック系列に対するABR波形応答について、75dBから始まり、5dB刻みで5dBまでステップダウンするルーチンをテストしました。これらのデータは、前述のようにして得られた19。また、トーンピップデータでツールをテストし、同様の結果を得ました。ほとんどのABRシステムからのABRデータは、.txt(ASCII)ファイルとしてエクスポートできます。ABR ASCIIファイルをコンピューターにロードし、プロトコルで説明されているようにRStudioで開きました。FindPeaks.Rルーチンをバッチ形式で実行した後、自動ラベル付け付きのサンプル波形(図1)と結果を含む.csvファイルを取得しました。結果は、無関係なピークを除去するためにレビューされました。自動ラベリングを検証するために、ABRプログラム機能を使用して、上記のクリックシリーズで取得した各波形の最初の5つのピークとトラフを手動でラベリングしました。このタスクを実行する実験者は、ABRデータの記録と分析に2年の経験がありました。 図2 は、この比較を示しており、自動化されたFindPeaks.Rデータは赤で、手動で取得したデータは黒で示されています。各トレースは、1 つのマウスからのデータを表します。1つの標準偏差を持つ両方の方法の平均も表示されます。FindPeaks.Rによって得られた結果は、手動で得られた結果と強く相関しています( 補足図S4を参照)。 図1:若いF1マウスの75dBクリック刺激に対する代表的な波形応答。 ミリ秒単位のレイテンシはx軸にプロットされ、マイクロボルト単位の振幅はy軸にプロットされます。ピークはFindPeaks.Rで自動的に識別され、赤でラベル付けされますが、トラフは青でラベル付けされます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:手動で特定されたピークから得られたデータと、FindPeaks.R分析によって提供されたデータの比較。 (A、C、E、G、I) マイクロボルト単位の振幅およびミリ秒単位の(B,D,F,H,J)遅延は、12匹のマウスに提示されたクリック刺激に対して得られた波形のピークI-Vについて、5 dB〜75 dB(x軸、すべてのグラフ)のサウンドレベルについてプロットされています。手動で取得した値(黒)は、FindPeaks.R(赤)で分析された同じデータセットと比較されます。平均は太い線としてプロットされ、影付きの領域は1つの標準偏差を表します。クラスカル-ウォリス順位和検定で評価した場合、方法間に差は見られませんでした(A、差= 0.0547977 ± 0.0010028、max = 0.96、p = 0.9216;B, 差 = −0.0001734 ± 0.0001214, max = 0.04, p = 0.8289;C, 差 = −0.0212209 ± 0.0006806, max = 0.92, p = 0.9687;D, 差 = −0.0011047 ± 0.0001556, max = 0.06, p = 0.771;E, 差 = −0.0323077 ± 0.0006169, max = 0.66, p = 0.899;F, 差 = −0.0072189 ± 0.0001460, max = 0.04, p = 0.8644;G、差 = 0.201754 ± 0.0007407、最大 = 0.64、p = 0.9312;H, 差 = −0.0007018 ± 0.0001717, max = 0.09, p = 0.8013;I, 差 = 0.0347561 ± 0.0007343, max = 1.05, p = 0.8856;J, 差 = −0.0078049 ± 0.0002762, max = 0.16, p = 0.886)、結果は高い相関性を示した(カイ二乗値: A, 0.009696;B, 0.046684;C, 0.0015395;D, 0.084742;E, 0.016102;F, 0.029153;G, 0.0074604;H, 0.063322;I、0.020699;J, 0.020544;SEM±平均値として提示された差。max = 絶対最大差)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 補足図S1:FindPeaks.Rによる分析 (A)作業ディレクトリの選択(プロトコルステップ3.2を参照)。(B)プログラムをロードする(プロトコルステップ3.3を参照)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図S2:波形解析用のスクリプト出力とコマンド。 (A)個々のファイルと(B)バッチ処理のコマンド。(C) ラベル付きのピークとトラフを含む波形を示すPDFファイルを出力します。プロトコルの手順 3.4 を参照してください。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図S3:解析の検証。 (A)波形データをロードします(プロトコルステップ4.1を参照)。(B) [アプリの実行 ] ボタンの場所。サンプルデータファイルも示されています。(C)波形のある 光沢のある 窓。この場合、サウンドレベルはトップウィンドウに入力された75dBです。目的のピークと次のトラフをクリックすると、振幅と遅延のデータが表に記録されます(プロトコルステップ4.6)。ピーク3のデータを示す。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図S4:手動で特定されたピークから得られた個々のデータと、FindPeaks.R分析によって提供されたデータの比較。 (A,C,E,G,I)マイクロボルト単位の振幅とミリ秒単位の(B、D、F、H、J)遅延は、12匹のマウスに提示されたクリック刺激に対して得られた波形のピークI〜Vについて、5dB〜75dB(x軸、すべてのグラフ)のサウンドレベルについてプロットされます。凡例に示されているように、各動物は固有の色でラベル付けされています。FindPeaks.Rで取得したデータは単色でラベル付けされ、手動で取得したデータは同じ色の彩度の低いバージョンでラベル付けされます。この図では両方のデータセットがプロットされていますが、それらが同一である場合、1本の線だけが明らかになります。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

この出版物で説明されているプロトコルは、クリックおよびトーンピップに対するABRの電圧振幅比および遅延間隔を記述するデータの取得を合理化するのに役立つはずです。RStudio で 1 つのコマンドを使用することで、実験者はこの情報を抽出、コンパイルし、統計分析のために 1 つのドキュメントに表示できます。この分析をルーチン化することにより、この分野が、発達、老化、または異なる種への侮辱によってABRを変化させることができる新しい方法を発見することを願っています。このような情報は、ノイズ²からシナプトパシーに類似した重要なメカニズムを特定するために価値がある可能性があります。この実験に使用された若いマウスは、おそらく聴覚脳幹がこの²⁰歳でまだ成熟しているため、反応が大きく変動しました。それにもかかわらず、2つの定量方法は非常に強い相関を示しました(図2)。

このスクリプトでは、「Time.csv」というファイルを使用して、ピーク識別用のデータ内の間隔を設定します。簡単に言うと、指定された時間間隔で発生する最大電圧振幅には「ピーク1」というラベルが付けられ、次の間隔で発生する最小電圧振幅には「トラフ1」というラベルが付けられます。生後1か月から12か月のCBA/CaJマウスのクリック応答とトーンピップ応答の両方の潜時を含む間隔を、8kHzから32kHzの周波数を使用して選択しました。このツールを使用して、マウスのトーンピップ応答も測定することに成功しました。ヒトを含む他の種も同様のウィンドウ内でABR応答を示しており、このツールは他の種のデータにも使用できると予想しています。優れた波形を生成するヒト²¹の新しい並列ABR法を使用することをお勧めします。時間間隔の制限により、このツールの使用は即時の ABR 応答の評価に制限されます。ただし、このファイルの間隔データは、音声に対するABR応答または音に応答して異なる時間に特徴的に発生するイベント関連電位(ERP)の測定を自動化するために、ユーザーによって変更される可能性があることに注意してください。

このデータの統計的処理のいくつかの特徴は強調する価値があります。私たちの知る限り、この分野には振幅進行を区別するための標準化された治療法がありません。初期の研究ではANOVA^22,23を使用していました。ここでのクリック系列のデータ(図2)はノンパラメトリックであり、クラスカル-ウォリス順位和検定の使用につながりました。ANOVAと同様に、クラスカル-ウォリス順位和検定は、刺激の特定のレベルで得られた値の違いを評価します。つまり、グラフ上で得られた線を比較します。ただし、他の治療法も可能です。生物学的には、振幅の進行は、刺激レベルが増加するにつれて、より高い閾値ニューロンの追加動員を反映しています。これは、線の積分を表す曲線の下の領域がより適切な尺度である可能性があることを示唆しています。一般化推定方程式(GEE)は、Patelら5のように、積分分析のために個々のデータをモデル化するために^{使用することができる。}特に、GEE分析では、これらの実験の繰り返し測定設計を考慮に入れることができます。より多くの研究者がデータ分析方法を議論するにつれて、ベストプラクティスに関するコンセンサスの出現が予想されます。

結論として、このホワイトペーパーでは、ABR波形を測定、コンパイル、および視覚化するための無料で使いやすいツールを紹介します。これらのツールは、このプロトコルに従うことでRStudioの初心者の学生が使用でき、厳密さと再現性を向上させるためのブラインドステップが組み込まれています。日常的なABR波形分析により、聴覚機能に影響を与える可能性のある侮辱、遺伝的変異、およびその他の治療法の発見が可能になると予測しています。

Materials

C57BL/6J  mice	Jackson Labs	664
CBA/CaJ mice	Jackson Labs	654
E-series PC	Dell	n/a (this equipment was discontinued)	This runs the IHS system.
Mini-anechoic chamber	Industrial Acoustics Company	Special order number 104306	This enclosure reduces noise levels for auditory testing of animals.
Optiplex 7040	Dell	i5-6500	Rstudio may also be run on a Mac or Linux system.
Universal Smart Box	Intelligent Hearing Systems	n/a (this equipment was discontinued)	Both TDT and IHS can output hearing data as ASCII files.