В пробирке Исследование влияния богатого гиалуронаном внеклеточного матрикса на миграцию клеток нервного гребня
Summary
В этом протоколе описывается эксперимент по миграции in vitro , подходящий для функционального анализа молекул, участвующих в миграции клеток нервного гребня in vivo во внеклеточный матрикс, богатый гиалуронаном.
Abstract
Клетки нервного гребня (NCC) представляют собой сильно мигрирующие клетки, которые происходят из дорсальной области нервной трубки. Эмиграция NCC из нервной трубки является важным процессом для производства NCC и их последующей миграции к целевым участкам. Миграционный путь NCC, включая окружающие ткани нервной трубки, включает внеклеточный матрикс, богатый гиалуроновой кислотой (ГК). Для моделирования миграции NCC в эти богатые ГК окружающие ткани из нервной трубки в этом исследовании был создан смешанный анализ миграции субстрата, состоящий из ГК (средняя молекулярная масса: 1,200-1,400 кДа) и коллагена типа I (Col1). Этот анализ миграции показывает, что клетки клеточной линии NCC, O9-1, сильно мигрируют на смешанном субстрате и что покрытие HA деградирует в месте очаговых спаек в ходе миграции. Эта модель in vitro может быть полезна для дальнейшего изучения механистического базиса, участвующего в миграции NCC. Этот протокол также применим для оценки различных субстратов в качестве каркасов для изучения миграции NCC.
Introduction
Клетки нервного гребня (NCC) представляют собой мультипотентную клеточную популяцию, которая присутствует в развивающихся эмбрионах, и они происходят из границы нервной пластинки во время нейруляции. Они способствуют формированию различных тканей, включая периферическую нервную систему, сердечно-сосудистую систему, черепно-лицевые ткани и скелет1. После индукции и спецификации NCC на границе нервной пластинки NCC эмигрируют из нейроэпителия и мигрируют к тканевым участкам, полученным из NCC1.
Гиалуронан (ГК) представляет собой несульфатированный гликозаминогликан, который распределяется в различных тканях как компонент внеклеточного матрикса (ECM). Важность гиалуроновой кислоты в развитии эмбриона была продемонстрирована в модельных системах путем абляции генов, ответственных за метаболизм гиалуроновой кислоты. Например, было обнаружено, что мутации в генах гиалуроновой синтазы (Has1 и Has2) у Xenopus приводят к дефектам миграции NCC и черепно-лицевой мальформации2. Кроме того, сообщалось, что HA-связывающие протеогликаны, аггрекан и версикан, оказывают ингибирующее действие на миграцию NCC3. У мышей абляция Has2 приводит к серьезным дефектам формирования эндокардиальной подушки, что приводит к летальности в середине беременности (E9,5-10) 4,5,6.
Недавно было продемонстрировано, что трансмембранный белок 2 (Tmem2), гиалуронидаза клеточной поверхности, играет решающую роль в стимулировании адгезии и миграции раковых клеток, опосредованных интегрином, путем удаления матрикс-ассоциированной ГК в местах адгезии 7,8. Совсем недавно Inubushi et al.9 продемонстрировали, что дефицит Tmem2 приводит к тяжелым черепно-лицевым дефектам из-за аномалий в эмиграции/миграции и выживаемости NCC. В предыдущем исследовании9 экспрессия Tmem2 была проанализирована во время формирования и миграции NCC. Экспрессия Tmem2 наблюдалась в месте расслоения NCC и в эмигрирующих Sox9-положительных NCC (рис. 1). Кроме того, с использованием истощенных Tmem2 клеток нервного гребня мыши O9-1 исследование показало, что экспрессия Tmem2 in vitro необходима для формирования фокальных спаек клетками O9-1 и их миграции в HA-содержащие субстраты (рис. 2 и рис. 3)9.
Эти результаты убедительно указывают на то, что Tmem2 также важен для адгезии и миграции NCC через HA-богатый ECM. Однако молекулярный механизм адгезии и миграции NCC в богатом ГК ECM до сих пор неясен. Поэтому необходимо создать экспериментальную систему культивирования in vitro для полного изучения адгезии и миграции NCC в богатом ГК ECM.
Из многочисленных подходов, используемых при тестировании миграции клеток, анализ на основе закрытия клеточной раны является простым методом, часто используемым в области физиологии и онкологии10. Этот подход полезен из-за его актуальности для фенотипа in vivo и эффективен при определении роли лекарств и хемоаттрактантов во время миграции клеток11. Можно оценить миграционную способность как целых клеточных масс, так и отдельных клеток, измеряя расстояния между клеточными промежутками во времени11. В этой рукописи модифицированный анализ, основанный на закрытии раны in vitro , представлен для моделирования миграции NCC в богатые ГК ткани, окружающие нервную трубку. Эта процедура также применима для изучения различных компонентов ECM (например, коллагенов, фибронектина и ламинина) для анализа роли каркаса ECM в миграции NCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Различные компоненты ECM регулируют эмиграцию/миграцию NCC. Например, HA положительно регулирует миграцию NCC 2,15. Интересно, что исследование, основанное на генетических мышиных моделях Tmem2, гиалуронидазы клеточной поверхности, выявило необходимость деграда…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Я выражаю огромную признательность Фумитоси Ириэ и Ю Ямагути за их поддержку и добрые предложения в создании этого метода. Эта работа была поддержана грантами для научно-исследовательских программ от Японского общества содействия науке (#19KK0232 до T.I., #20H03896 до T.I.). Оригинальный метод нанесения ГК на стеклянные подложки и анализов деградации ГК in situ на подложках был описан в Yamamoto et al. (2017)8, в то время как метод получения смешанных субстратов HA/Col1 был описан в Irie et al. (2021)7.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Biologie du développement. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
