Multiplexed stregkode billedanalyse har for nylig forbedret karakteriseringen af tumormikromiljøet, hvilket tillader omfattende undersøgelser af cellesammensætning, funktionel tilstand og celle-celle-interaktioner. Heri beskriver vi en farvnings- og billeddannelsesprotokol ved hjælp af stregkoden af oligonukleotidkonjugerede antistoffer og cyklusbilleddannelse, som muliggør anvendelse af en højdimensionel billedanalyseteknik.
Multiplexed billeddannelsesteknologi ved hjælp af antistofstregkodning med oligonukleotider, som sekventielt detekterer flere epitoper i samme vævssektion, er en effektiv metode til tumorevaluering, der forbedrer forståelsen af tumormikromiljøet. Visualiseringen af proteinekspression i formalinfikserede, paraffinindlejrede væv opnås, når en specifik fluorofor udglødes til en antistofbundet stregkode via komplementære oligonukleotider, og derefter udføres prøvebilleddannelse; Faktisk tillader denne metode brugen af tilpassede paneler med mere end 40 antistoffer i en enkelt vævsfarvningsreaktion. Denne metode er kompatibel med frisk frosset væv, formalinfikseret, paraffinindlejret væv, dyrkede celler og mononukleære celler i perifert blod, hvilket betyder, at forskere kan bruge denne teknologi til at se en række prøvetyper ved enkeltcelleopløsning. Denne metode starter med en manuel farvnings- og fastgørelsesprotokol, og alle antistofstregkoder påføres ved hjælp af en antistofcocktail. Farvningsfluidikinstrumentet er fuldt automatiseret og udfører iterative cyklusser med mærkning, billeddannelse og fjernelse af spektralt forskellige fluoroforer, indtil alle biomarkører er blevet afbildet ved hjælp af et standard fluorescensmikroskop. Billederne indsamles og kompileres derefter på tværs af alle billeddannelsescyklusser for at opnå enkeltcelleopløsning for alle markørerne. Enkelttrinsfarvning og skånsom fjernelse af fluorofor giver ikke kun mulighed for stærkt multiplekset biomarkøranalyse, men bevarer også prøven til yderligere nedstrømsanalyse, hvis det ønskes (f.eks. Hæmatoxylin og eosinfarvning). Desuden muliggør billedanalysesoftwaren billedbehandling-drift kompensation, baggrundssubtraktion, cellesegmentering og klyngedannelse – samt visualisering og analyse af billeder og cellefænotyper til generering af rumlige netværkskort. Sammenfattende anvender denne teknologi et computeriseret mikrofluidiksystem og fluorescensmikroskop til iterativt at hybridisere, afbilde og strippe fluorescerende mærkede DNA-sonder, der er komplementære til vævsbundne, oligonukleotidkonjugerede antistoffer.
Tumormikromiljøet (TME) er ekstremt heterogent og består af tumorceller, tumorstromale celler, immunceller, ikke-cellulære komponenter i den ekstracellulære matrix og talrige rigelige molekyler produceret og frigivet af tumor-, stromale og immunceller 1,2. Akkumulerende beviser viser, at TME har en central rolle i omprogrammering af tumordifferentiering, vækst, invasion, metastase og respons på terapier3.
At forstå, hvordan forskellige celletyper i TME interagerer og kommunikerer med hinanden gennem signalnetværk, er afgørende for at forbedre kræftdiagnosen, optimere immunterapi og udvikle nye behandlinger4. Traditionelle vævsmikroskopiteknikker, herunder immunhistokemi (IHC) og immunofluorescens (IF), er blevet brugt i årtier til at studere celletyper, overflod og kommunikation i tumorprøver. Desværre kan disse teknikker typisk kun evaluere en eller to proteinmarkører i et vævsafsnit og kan ikke afsløre de komplekse rumlige og strukturelle forhold mellem disse celler 5,8,7.
I løbet af de sidste to årtier er der etableret flere multipleksede billedteknologier8. Disse teknologier giver meget bedre overblik over immuncellernes sammensætning, funktion og placering i TME’en, hvilket fører til hurtige fremskridt i evnen til at identificere og profilere komplekse TME’er rumligt på enkeltcelleniveau 9,10. De rumlige og strukturelle forhold mellem forskellige tumor- og immunceller i TME er nu i spidsen for biologiske og kliniske undersøgelser ved hjælp af disse multipleksede billeddannelsesteknologier11,12.
Den nyligt udviklede multipleksede billeddannelsesteknologi ved hjælp af oligonukleotidkonjugeret antistofkodning er en indflydelsesrig enkeltcelle biologisk forskningsplatform baseret på påvisning af oligonukleotidkonjugerede antistoffer i formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) prøver13,14. I øjeblikket giver denne multipleksede billeddannelsesteknologi mulighed for samtidig billeddannelse af mere end 100 markører i en enkelt vævssektion15, hvilket har øget antallet af celletyper, der kan skelnes in situ. Dette muliggør et niveau af rumlig analyse af tumor- og immunceller, der ikke er muligt ved hjælp af traditionelle immunofænotypemetoder16.
Heri beskriver vi en optimeret protokol til konjugering af oprensede antistoffer mod oligonukleotider og validering af denne konjugering ved hjælp af den multipleksede billeddannelsesplatform og en multicyklusbilleddannelsesprocedure med FFPE-væv. Derudover beskriver vi de grundlæggende billedbehandlings- og dataanalyseprocedurer, der anvendes med denne teknologi.
TME spiller en væsentlig rolle i kræftudvikling, progression og behandlingsrespons. Derudover kan tætheden af specifikke tumorinfiltrerende lymfocytundergrupper i TME tjene som en prognostisk biomarkør for visse typer kræft. Bemærkelsesværdigt kan en tumors rumlige egenskaber ud over TME’s cellulære sammensætning give en oversigt til forståelse af tumorens biologi og identifikation af potentielle prognostiske biomarkører12,17.
Da mange immuncellepopulationer er involveret i procancer- eller anticancerresponser, vil en bedre forståelse af disse celler og deres rumlige forhold til hinanden og med kræftceller hjælpe med at guide identifikationen af nye immunterapeutiske strategier. Tidligere undersøgelser har stratificeret placeringen og den rumlige fordeling af TME-celler baseret på vævsstrukturen i de intratumorale og peritumorale områder og tumorcellernes invasive margener18,19. I løbet af de sidste 15 år har teknologiske fremskridt gjort fænotypisk analyse af individuelle celler baseret på deres rumlige spredning til et nyt, indflydelsesrigt værktøj til at studere TME og kategorisere potentielle biomarkører for tumorimmunterapi. Multiplex IF histokemi kan samtidig estimere flere biologiske markører20.
I lighed med oligonukleotid-konjugeret antistofstrategi anvendes fire typer proteinbaserede multiplexplatforme til at studere TME: kromogen-, fluorescens-, DNA-stregkode- og metalisotopmærkede antistofdetekteringssystemer. De omkostningseffektive kromogene IHC-platforme muliggør heldiasvisualisering og patologisk vurdering ved hjælp af konventionel lysfeltmikroskopi. I multiplexet IF og IHC anvendes antistoffer konjugeret med fluoroforer. Multiplex IF/IHC-platformen detekterer antistoffer med høj specificitet og kan kvantificere målrettede antistoffer selv på subcellulært niveau 6,21. På grund af kromogenernes og fluoroforernes natur kan brugen af et antistofpanel desuden fange ekspressionen af op til 10 biomarkører på et enkelt dias. På metalisotopbaserede platforme anvendes metalmærkede antistoffer til at udføre multiplekset billeddannelse med enkeltcelle- og rumlig opløsning og høj følsomhed for individuelle vævssektioner22. Teoretisk set muliggør disse metalkonjugerede antistofmetoder samtidig påvisning af mere end 100 biomarkører på en enkelt vævssektion. En udfordring ved isotopmærkningsteknikken er isobarisk interferens, som forhindrer 100% renhed af berigelse i at blive nået23. Desuden øges interferensen, når antallet af markører øges. DNA-konjugerede antistofdetekteringsplatforme genkender antistoffer mærket med unikke DNA-stregkoder. Mere end 40 biomarkører kan fanges samtidigt med høj specificitet på disse platforme6.
Multiplexed imaging er en kommercielt tilgængelig DNA-stregkodemærket antistofdetekteringsplatform til påføring af DNA-konjugerede antistoffer på et enkelt vævsglas i et trin (figur 8). Til vævsforberedelsesfasen, i modsætning til den multipleksede ionstrålebilleddannelsesplatform, som kræver brug af guldbelagte dias opnået fra producenter, kræver den multipleksede billeddannelsesplatform kun regelmæssige dæksedler eller dias belagt med 0,1% poly-L-lysin for at hjælpe vævet med at klæbe til det og holde vævet intakt under farvnings- og billeddannelsesprocessen. Brug af vævssektioner på dæksedler inden for 4 uger efter sektionering anbefales, da langvarig opbevaring af ufarvede dias resulterer i antigenicitetsreduktion. En farvet dækslipprøve kan opbevares i opbevaringsbuffer ved 4 °C i op til 2 uger uden at miste farvesignalet. Der kræves ikke specielt udstyr til opbevaring af dækslipprøverne. Det multipleksede billeddannelsessystem er blevet opgraderet til at bruge almindelige dias i stedet for dæksedler, hvilket muliggør farvning af større væv og nem håndtering. Ved anvendelse af en reduktionsopløsning til antistofkonjugering (trin 3.2.3) bør reaktionen begrænses til højst 30 min for at forhindre beskadigelse af antistoffer. De blokerende buffere i trin 5.6.6 skal være frisklavede, og blokeringsbufferne må ikke genbruges.
Sammenlignet med kromogen-, fluorescens- og metalisotopmærkede multiplex-antistofdetekteringsplatforme har den multipleksede billeddannelsesteknologi visse fordele. For eksempel er mere end 60 foruddesignede antistofpaneler til multiplexbilleddannelse kommercielt tilgængelige, hvilket hjælper med at spare tid og omkostninger ved antistofkonjugering og validering, og antallet af foruddesignede antistofpaneler vokser. Disse antistoffer, som omfatter carcinommarkøren pan-cytokeratin, melanommarkøren SOX10, den vaskulære markør CD31, stromalmarkøren SMA og adskillige immuncellemarkører, er valideret og eksperimentklar. For antistoffer, der ikke er prædesignet, er det kommercielt tilgængelige konjugationssæt designet til brug med multiplexbilleddannelse ligetil og brugervenligt. Kundekonjugerede antistoffer er gode i 1 år, når de opbevares ved 4 °C. Derudover kræves der ikke maskinopvarmning for at tage billederne. I denne multipleksede billeddannelsesteknologi resulterer de iterative vaske-, hybridiserings- og stripping-trin i billedoptagelsen sjældent i nedsat markørintensitet eller nedbrudt vævsmorfologi 5,24,25. Desuden optages sammensatte billeder i QPTIFF-format med et simpelt trefarvet fluorescensmikroskop og kan uploades og analyseres ved hjælp af tredjeparts digital analysesoftware. Farvningsmarkørerne kan visualiseres ved enkeltcelleopløsning, og cellefænotyper kan karakteriseres via co-lokalisering af markørerne (figur 6 og figur 7). Den omfattende analyse af et multiplekset billede afslører yderligere vævsrummene, kvantificering af enkeltcellemarkører og nærmeste nabo- og nærhedsdata (figur 8).
En udfordring i multiplekset billedanalyse er celletypeidentifikation. Normalt, når flere enkeltobjektklassifikatorer anvendes på et billede, vil mere usædvanlige fænotyper blive kommenteret. Derfor anbefales det at bruge kendte markører, der ikke er co-udtrykt i den samme klassifikator, og kun anvende den fænotyperelaterede klassifikator til annoteringen af enkeltceller. Variationer i celletypeannotation vil resultere i væsentligt forskellige rumlige resultater, såsom forskelle i cellerumlig fordeling og cellulær kvarteranalyse26,27.
Multiplexed billedanalyse har vist sig at være vellykket til farvning og billeddannelse af mange prøvetyper, herunder FFPE-væv, frisk frosset væv, arkiverede hele dias og vævsmikroarrays. Multiplexede billeder af bryst-, hjerne-, lunge-, milt-, nyre-, lymfeknude- og hudvævssektioner kan erhverves med dybe enkeltcellede rumlige fænotypedata 5,16,25,28.
I fremtiden forventes flere prædesignede antistoffer til multiplekset billeddannelse. Derudover er udviklingen af specifik software til multiplexet billedanalyse meget nødvendig. I øjeblikket findes der mange kommercielt tilgængelige og open source-softwareprogrammer til Hi-Plex-billedanalyse29, men forskere har stadig brug for hjælp til at skabe en standardarbejdsgang for disse analyser30,31. Selvom de sammensatte billeder, der er taget ved hjælp af denne protokol, er kompatible med tredjepartssoftware, kan dette resultere i ekstra omkostninger for brugeren. En anden ulempe ved den multipleksede billeddannelsesteknologi er signalreduktionen i nuklear proteindetektion efter iterativ vask, hybridisering og stripping med store paneler af antistoffer. Heldigvis kan dette minimeres ved at hente de stregkodede fluoroforer i tidlige cyklusser, når reporterpladerne designes. For nylig blev denne platform opgraderet med et nyt højhastighedsscanningssystem, hvilket dramatisk har reduceret tiden til at opnå sammensatte billeder32. Derudover er en ny strategi ved hjælp af tyramidkonjugerede stregkoder blevet rapporteret for at forbedre oligonukleotid-konjugeret antistof-stregkodningsbaseret billeddannelse. Denne teknologi har til formål at forstærke farvningssignaler, for hvilke stregkodekonjugerede antistoffer er vanskelige at opnå33.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Donald R. Norwood fra Editing Services, Research Medical Library ved MD Anderson for redigering af denne artikel og multiplex IF og billedanalyselaboratoriet i Institut for Translationel Molekylær Patologi ved MD Anderson. Dette projekt blev delvist støttet af Translational Molecular Pathology-Immunoprofiling laboratory (TMP-IL) Moonshots Platform ved Institut for Translationel Molekylær Patologi, University of Texas MD Anderson Cancer Center og NCI Cooperative Agreement U24CA224285 (til MD Anderson Cancer Center CIMAC).
10x AR9 Buffer | Akoya Biosciences | AR900250ML | |
10x Buffer | Akoya Biosciences | 7000001 | |
16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28906 | |
1X Antibody Diluent/Block | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
Antibody Conjugation Kit | Akoya Biosciences | 7000009 | Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution |
Assay Reagent | Akoya Biosciences | 7000002 | |
Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
Dimethyl sulfoxide | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
Ethanol, 200 proof | |||
G Blocker V2 | Akoya Biosciences | 240199 | |
Histoclear | Thermo Fisher Scientific | 50-329-50 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
Milli-Q Integral 10 | Millipore | ZRXQ010WW | |
Niknon Fluorescence microscope | Keyence Corp. of America | BZ-X810 | |
Nuclear Stain | Akoya Biosciences | 7000003 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
NuPAGE | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination | Akoya Biosciences | 5450004 (BX025/RX025) | |
5450003 (BX022/RX022) | |||
5450023 (BX002/RX002) | |||
5250002 (BX020/RX020) | |||
2520003 (BX023/RX023) | |||
5250005 (BX029/RX029) | |||
5250007 (BX035/RX035) | |||
5250012 (BX052/RX052) | |||
5550012 (BX030/RX030) | |||
5550015 (BX042/RX042) | |||
5550014 (BX036/RX036) | |||
QuPath | Open-Source | https://qupath.github.io/ | |
SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6065 | |
Staining Kit | (Akoya Biosciences | 7000008 | Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer |