Mouse In Vivo Placental Alvo CRISPR Manipulação
Summary
Aqui descrevemos um método tempo-específico para manipular efetivamente vias críticas de desenvolvimento na placenta de camundongos in vivo. Isto é realizado através da injeção e eletroporação de plasmídeos CRISPR nas placentas de fêmeas grávidas no dia embrionário 12.5.
Abstract
A placenta é um órgão essencial que regula e mantém o desenvolvimento dos mamíferos no útero. A placenta é responsável pela transferência de nutrientes e resíduos entre a mãe e o feto e pela produção e entrega de fatores de crescimento e hormônios. Manipulações genéticas placentárias em camundongos são críticas para a compreensão do papel específico da placenta no desenvolvimento pré-natal. Camundongos transgênicos que expressam Cre específicos da placenta têm eficácia variável, e outros métodos para manipulação gênica placentária podem ser alternativas úteis. Este artigo descreve uma técnica para alterar diretamente a expressão gênica placentária usando a manipulação do gene CRISPR, que pode ser usada para modificar a expressão de genes-alvo. Usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada, as fêmeas grávidas são submetidas a uma laparotomia no dia embrionário 12.5 (E12.5), e um plasmídeo CRISPR é entregue por uma micropipeta de vidro nas placentas individuais. O plasmídeo é eletroporado imediatamente após cada injeção. Após a recuperação da barragem, as placentas e embriões podem continuar o desenvolvimento até a avaliação em um momento posterior. A avaliação da placenta e da prole após o uso dessa técnica pode determinar o papel da função placentária tempo-específica no desenvolvimento. Esse tipo de manipulação permitirá uma melhor compreensão de como a genética e a função placentárias afetam o crescimento e o desenvolvimento fetal em múltiplos contextos patológicos.
Introduction
A placenta é um órgão essencial envolvido no desenvolvimento do feto. O principal papel da placenta é fornecer fatores essenciais e regular a transferência de nutrientes e resíduos de e para o feto. As placentas de mamíferos são compostas por tecido fetal e materno, que compõem a interface feto-materna e, portanto, a genética da função de impacto materno-fetal1. Anomalias genéticas ou função prejudicada da placenta podem alterar drasticamente o desenvolvimento fetal. Trabalhos anteriores mostraram que a genética e o desenvolvimento placentário estão associados ao desenvolvimento alterado de sistemas orgânicos específicos no feto. Particularmente, anormalidades na placenta estão ligadas a alterações no cérebro, coração e sistema vascular fetal2,3,4,5.
O transporte de hormônios, fatores de crescimento e outras moléculas da placenta para o feto desempenha um papel importante no desenvolvimento fetal6. Tem sido demonstrado que alterar a produção placentária de moléculas específicas pode alterar o neurodesenvolvimento. A inflamação materna pode aumentar a produção de serotonina por alterar a expressão gênica metabólica do triptofano (TRP) na placenta, o que, posteriormente, cria um acúmulo de serotonina no cérebro fetal7. Outros estudos encontraram anormalidades placentárias ao lado de defeitos cardíacos. Acredita-se que anormalidades na placenta contribuam para defeitos cardíacos congênitos, o defeito congênito mais comum em humanos8. Um estudo recente identificou vários genes que têm vias celulares semelhantes na placenta e no coração. Se rompidas, essas vias podem causar defeitos em ambos os órgãos9. Os defeitos na placenta podem exacerbar defeitos cardíacos congênitos. O papel da genética e função placentária no desenvolvimento de sistemas de órgãos fetais específicos é um campo de estudo emergente.
Camundongos possuem placentas hemocoriais e outras características das placentas humanas, o que os torna modelos altamente úteis para o estudo de doenças humanas1. Apesar da importância da placenta, atualmente há uma falta de manipulações genéticas direcionadas in vivo. Além disso, atualmente há mais opções disponíveis para knockouts ou knockdowns do que manipulações de superexpressão ou ganho de função na placenta10. Existem várias linhas transgênicas de Cre-expressando para manipulação placentária-específica, cada uma em diferentes linhagens de trofoblastos em diferentes pontos de tempo. Estes incluem Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER, e Gcm1-Cre 11,12,13,14. Embora esses transgenes Cre sejam eficientes, eles podem não ser capazes de manipular alguns genes em pontos de tempo específicos. Outro método comumente utilizado para nocautear ou superexpressar a expressão gênica placentária é a inserção de vetores lentivirais em cultura de blastocisto, o que causa uma manipulação genética trofoblasto-específica15,16. Esta técnica permite uma mudança robusta na expressão gênica placentária no início do desenvolvimento. O uso de RNA de interferência in vivo tem sido pouco utilizado na placenta. A inserção de plasmídeos de shRNA pode ser realizada de forma semelhante à técnica CRIPSR descrita neste trabalho. Isso foi feito no E13.5 para diminuir com sucesso a expressão de PlGF na placenta, com impactos na vasculatura cerebral da prole17.
Além das técnicas que são usadas principalmente para knockout ou knockdown, a indução da superexpressão é comumente realizada com adenovírus ou a inserção de uma proteína exógena. As técnicas utilizadas para superexpressão têm taxas variáveis de sucesso e têm sido realizadas, na maioria das vezes, mais tardiamente na gestação. Para investigar o papel do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) na função placentária, uma transferência gênica placentária mediada por adenovírus foi realizada para induzir a superexpressão do gene IGF-1 18,19. Isso foi realizado no final da gestação de camundongos com E18.5 por injeção direta na placenta. Para fornecer opções adicionais e contornar possíveis falhas de manipulações genéticas placentárias estabelecidas, como falhas na combinação Cre-Lox, a possível toxicidade de adenovírus e os efeitos fora do alvo do shRNA, a manipulação direta in vivo de CRISPR da placenta pode ser usada20,21,22. Este modelo foi desenvolvido para resolver a falta de modelos de superexpressão e para criar um modelo com flexibilidade.
Essa técnica é baseada no trabalho de Lecuyer e cols., no qual plasmídeos shRNA e CRISPR foram direcionados diretamente in vivo para placentas de camundongos para alterar a expressão de PlGF 17. Esta técnica pode ser usada para alterar diretamente a expressão gênica placentária usando a manipulação de CRISPR em vários pontos de tempo; para este trabalho, foi selecionado o E12.5. A placenta já amadureceu a esse ponto e é grande o suficiente para manipular, permitindo a inserção de um plasmídeo CRISPR específico no E12.5, o que pode ter um impacto significativo no desenvolvimento fetal a partir de meados da gestação23,24. Ao contrário das abordagens transgênicas, mas semelhantes às induções virais ou interferência de RNA, esta técnica permite a superexpressão ou knockout em pontos de tempo específicos usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada, evitando assim possível placentação prejudicada ou letalidade embrionária de alterações anteriores. Como apenas algumas placentas recebem o plasmídeo experimental ou de controle dentro de uma ninhada, a abordagem permite dois tipos de controles internos. Esses controles são aqueles injetados e eletroporados com o plasmídeo de controle apropriado e aqueles que não recebem manipulação direta. Esta técnica foi otimizada para criar uma superexpressão do gene IGF-1 na placenta de camundongos através de um plasmídeo CRISPR mediador de ativação sinérgica (SAM). O gene IGF-1 foi escolhido, pois o IGF-1 é um hormônio de crescimento essencial entregue ao feto que é primariamente produzido na placenta antes do nascimento25,26. Esta nova técnica CRISPR direcionada à placenta permitirá a manipulação direta para ajudar a definir a conexão entre a função placentária e o desenvolvimento fetal.
Protocol
Representative Results
Discussion
A placenta é um regulador primário do crescimento fetal e, como observado anteriormente, alterações na expressão ou função gênica placentária podem afetar significativamente o desenvolvimento fetal6. O protocolo descrito aqui pode ser usado para realizar uma manipulação CRISPR in vivo direcionada da placenta de camundongo usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada. Esta técnica permite um rendimento significativo de embriões viáveis e suas placentas corresponden…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem as seguintes fontes de financiamento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 e NIH T32GM145441. Os autores agradecem aos laboratórios do Dr. Val Sheffield e do Dr. Calvin Carter na Universidade de Iowa pelo uso de sua sala de cirurgia e equipamentos, bem como ao Dr. Eric Van Otterloo, ao Dr. Nandakumar Narayanan, e ao Dr. Matthew Weber por sua assistência com microscopia. Os autores também agradecem à Dra. Sara Maurer, Maya Evans e Sreelekha Kundu por sua assistência com as cirurgias piloto.
Materials
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD – Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 – 44 – 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂ |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24×60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD – Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
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