Manipolazione CRISPR mirata alla placenta del mouse in vivo
Summary
Qui descriviamo un metodo specifico del tempo per manipolare efficacemente i percorsi di sviluppo critici nella placenta del topo in vivo. Questo viene eseguito attraverso l’iniezione e l’elettroporazione di plasmidi CRISPR nelle placente di madri gravide il giorno embrionale 12.5.
Abstract
La placenta è un organo essenziale che regola e mantiene lo sviluppo dei mammiferi in utero. La placenta è responsabile del trasferimento di nutrienti e rifiuti tra la madre e il feto e della produzione e consegna di fattori di crescita e ormoni. Le manipolazioni genetiche placentari nei topi sono fondamentali per comprendere il ruolo specifico della placenta nello sviluppo prenatale. I topi transgenici che esprimono Cre specifici per la placenta hanno un’efficacia variabile e altri metodi per la manipolazione genica placentare possono essere alternative utili. Questo articolo descrive una tecnica per alterare direttamente l’espressione genica placentare utilizzando la manipolazione genica CRISPR, che può essere utilizzata per modificare l’espressione di geni mirati. Utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato, le madri gravide subiscono una laparotomia al giorno embrionale 12.5 (E12.5) e un plasmide CRISPR viene somministrato da una micropipetta di vetro nelle singole placente. Il plasmide viene immediatamente elettroporato dopo ogni iniezione. Dopo il recupero della madre, la placenta e gli embrioni possono continuare lo sviluppo fino alla valutazione in un secondo momento. La valutazione della placenta e della prole dopo l’uso di questa tecnica può determinare il ruolo della funzione placentare specifica del tempo nello sviluppo. Questo tipo di manipolazione consentirà una migliore comprensione di come la genetica e la funzione placentare influenzano la crescita e lo sviluppo fetale in più contesti patologici.
Introduction
La placenta è un organo essenziale coinvolto nello sviluppo del feto. Il ruolo principale della placenta è quello di fornire fattori essenziali e regolare il trasferimento di nutrienti e rifiuti da e verso il feto. Le placente dei mammiferi sono composte da tessuto fetale e materno, che costituiscono l’interfaccia fetale-materna e, quindi, la genetica della madre e del feto influisce sulla funzione1. Anomalie genetiche o compromissione della funzione della placenta possono alterare drasticamente lo sviluppo fetale. Lavori precedenti hanno dimostrato che la genetica e lo sviluppo placentare sono associati allo sviluppo alterato di specifici sistemi di organi nel feto. In particolare, le anomalie nella placenta sono legate a cambiamenti nel cervello fetale, nel cuore e nel sistema vascolare 2,3,4,5.
Il trasporto di ormoni, fattori di crescita e altre molecole dalla placenta al feto svolge un ruolo importante nello sviluppo fetale6. È stato dimostrato che alterare la produzione placentare di molecole specifiche può alterare lo sviluppo neurologico. L’infiammazione materna può aumentare la produzione di serotonina alterando l’espressione genica metabolica del triptofano (TRP) nella placenta, che successivamente crea un accumulo di serotonina nel cervello fetale7. Altri studi hanno trovato anomalie placentari accanto a difetti cardiaci. Si ritiene che le anomalie nella placenta contribuiscano a difetti cardiaci congeniti, il difetto alla nascita più comune negli esseri umani8. Uno studio recente ha identificato diversi geni che hanno percorsi cellulari simili sia nella placenta che nel cuore. Se interrotti, questi percorsi potrebbero causare difetti in entrambi gli organi9. I difetti nella placenta possono esacerbare i difetti cardiaci congeniti. Il ruolo della genetica e della funzione placentare sullo sviluppo di specifici sistemi di organi fetali è un campo di studio emergente.
I topi hanno placente emocoriali e altre caratteristiche delle placente umane, il che li rende modelli molto utili per lo studio delle malattie umane1. Nonostante l’importanza della placenta, attualmente mancano manipolazioni genetiche mirate in vivo. Inoltre, ci sono attualmente più opzioni disponibili per knockout o knockdown rispetto alla sovraespressione o alle manipolazioni di guadagno di funzione nella placenta10. Esistono diverse linee transgeniche che esprimono il Cre per la manipolazione placentare-specifica, ognuna in diversi lignaggi di trofoblasti in diversi punti temporali. Questi includono Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER, e Gcm1-Cre 11,12,13,14. Mentre questi transgeni Cre sono efficienti, potrebbero non essere in grado di manipolare alcuni geni in punti temporali specifici. Un altro metodo comunemente usato per eliminare o sovraesprimere l’espressione genica placentare è l’inserimento di vettori lentivirali nella coltura di blastocisti, che causa una manipolazione genetica specifica del trofoblasto15,16. Questa tecnica consente un robusto cambiamento nell’espressione genica placentare nelle prime fasi dello sviluppo. L’uso dell’interferenza dell’RNA in vivo è stato scarsamente utilizzato nella placenta. L’inserimento di plasmidi shRNA può essere eseguito in modo simile alla tecnica CRIPSR descritta in questo articolo. Questo è stato fatto a E13.5 per ridurre con successo l’espressione di PlGF nella placenta, con impatti sulla vascolarizzazione cerebrale della prole17.
Oltre alle tecniche utilizzate principalmente per knockout o knockdown, l’induzione della sovraespressione viene comunemente eseguita con adenovirus o l’inserimento di una proteina esogena. Le tecniche utilizzate per la sovraespressione hanno tassi variabili di successo e sono state per lo più eseguite più tardi nella gestazione. Per studiare il ruolo del fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) nella funzione placentare, è stato eseguito un trasferimento genico placentare adenovirale-mediato per indurre la sovraespressione del gene IGF-1 18,19. Questo è stato eseguito tardi nella gestazione del topo su E18.5 tramite iniezione placentare diretta. Per fornire ulteriori opzioni e aggirare possibili fallimenti di manipolazioni genetiche placentari stabilite, come i fallimenti della combinazione Cre-Lox, la possibile tossicità degli adenovirus e gli effetti off-target dello shRNA, è possibile utilizzare la manipolazione diretta CRISPR in vivo della placenta20,21,22. Questo modello è stato sviluppato per ovviare alla mancanza di modelli di sovraespressione e per creare un modello con flessibilità.
Questa tecnica si basa sul lavoro di Lecuyer et al., in cui i plasmidi shRNA e CRISPR sono stati mirati direttamente in vivo alle placente di topo per alterare l’espressione di PlGF 17. Questa tecnica può essere utilizzata per alterare direttamente l’espressione genica placentare utilizzando la manipolazione CRISPR in più punti temporali; per questo lavoro è stato selezionato E12.5. La placenta è maturata a questo punto ed è abbastanza grande da manipolare, consentendo l’inserimento di uno specifico plasmide CRISPR su E12.5, che può avere un impatto significativo sullo sviluppo fetale da metà a fine gravidanza23,24. A differenza degli approcci transgenici, ma simile alle induzioni virali o all’interferenza dell’RNA, questa tecnica consente la sovraespressione o il knockout in particolari punti temporali utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato, evitando così possibili compromissione della placentazione o letalità embrionale da cambiamenti precedenti. Poiché solo poche placente ricevono il plasmide sperimentale o di controllo all’interno di una cucciolata, l’approccio consente due tipi di controlli interni. Questi controlli sono quelli iniettati ed elettroporati con il plasmide di controllo appropriato e quelli che non ricevono alcuna manipolazione diretta. Questa tecnica è stata ottimizzata per creare una sovraespressione del gene IGF-1 nella placenta del topo tramite un plasmide CRISPR mediatore di attivazione sinergica (SAM). È stato scelto il gene IGF-1, poiché IGF-1 è un ormone della crescita essenziale consegnato al feto che viene prodotto principalmente nella placenta prima della nascita25,26. Questa nuova tecnica CRISPR mirata alla placenta consentirà la manipolazione diretta per aiutare a definire la connessione tra la funzione placentare e lo sviluppo fetale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La placenta è un regolatore primario della crescita fetale e, come notato in precedenza, i cambiamenti nell’espressione o nella funzione genica placentare possono avere un impatto significativo sullo sviluppo fetale6. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per eseguire una manipolazione CRISPR mirata in vivo della placenta del topo utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato. Questa tecnica consente una resa significativa di embrioni vitali e delle loro placent…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono le seguenti fonti di finanziamento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 e NIH T32GM145441. Gli autori ringraziano i laboratori del Dr. Val Sheffield e del Dr. Calvin Carter presso l’Università dell’Iowa per l’uso della loro sala operatoria e delle attrezzature, così come il Dr. Eric Van Otterloo, il Dr. Nandakumar Narayanan, e il Dr. Matthew Weber per la loro assistenza con la microscopia. Gli autori ringraziano anche la dottoressa Sara Maurer, Maya Evans e Sreelekha Kundu per la loro assistenza con gli interventi chirurgici pilota.
Materials
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD – Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 – 44 – 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂ |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24×60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD – Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
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