Mus in vivo placenta målrettet CRISPR-manipulering
Summary
Her beskriver vi en tidsspesifikk metode for effektivt å manipulere kritiske utviklingsveier i musemorkaken in vivo. Dette utføres ved injeksjon og elektroporering av CRISPR-plasmider i morkakene til drektige dammer på embryonale dag 12.5.
Abstract
Morkaken er et viktig organ som regulerer og opprettholder pattedyrutvikling i livmoren. Morkaken er ansvarlig for overføring av næringsstoffer og avfall mellom mor og foster og produksjon og levering av vekstfaktorer og hormoner. Placenta genetiske manipulasjoner hos mus er avgjørende for å forstå morkakens spesifikke rolle i prenatal utvikling. Morkakespesifikke Cre-uttrykkende transgene mus har varierende effektivitet, og andre metoder for manipulering av placenta-gen kan være nyttige alternativer. Dette papiret beskriver en teknikk for direkte å endre placenta genuttrykk ved hjelp av CRISPR-genmanipulasjon, som kan brukes til å modifisere uttrykket av målrettede gener. Ved hjelp av en relativt avansert kirurgisk tilnærming gjennomgår gravide dammer en laparotomi på embryonal dag 12.5 (E12.5), og et CRISPR-plasmid leveres av en glassmikropipette inn i de enkelte placentaene. Plasmidet blir umiddelbart elektroporert etter hver injeksjon. Etter damutvinning kan morkakene og embryoene fortsette utviklingen til vurdering på et senere tidspunkt. Evalueringen av morkaken og avkom etter bruk av denne teknikken kan bestemme rollen som tidsspesifikk placentafunksjon i utviklingen. Denne typen manipulasjon vil gi en bedre forståelse av hvordan placenta genetikk og funksjon påvirker fosterets vekst og utvikling i flere sykdomskontekster.
Introduction
Morkaken er et viktig organ involvert i utviklingen av fosteret. Morkakens hovedrolle er å gi viktige faktorer og regulere overføringen av næringsstoffer og avfall til og fra fosteret. Pattedyrmorkaker består av både foster- og maternelt vev, som utgjør foster-mors grensesnitt, og dermed genetikken til både mor og fosterpåvirkningsfunksjon1. Genetiske anomalier eller nedsatt funksjon av morkaken kan drastisk endre fosterutvikling. Tidligere arbeid har vist at placenta genetikk og utvikling er forbundet med den endrede utviklingen av spesifikke organsystemer i fosteret. Spesielt er abnormiteter i morkaken knyttet til endringer i fosterets hjerne, hjerte og vaskulære system 2,3,4,5.
Transport av hormoner, vekstfaktorer og andre molekyler fra morkaken til fosteret spiller en viktig rolle i fosterets utvikling6. Det har vist seg at endring av placentaproduksjonen av spesifikke molekyler kan endre nevroutvikling. Mors betennelse kan øke produksjonen av serotonin ved å endre tryptofan (TRP) metabolsk genuttrykk i morkaken, som senere skaper en opphopning av serotonin i fosterets hjerne7. Andre studier har funnet placenta abnormiteter sammen med hjertefeil. Abnormaliteter i morkaken antas å bidra til medfødte hjertefeil, den vanligste fødselsdefekten hos mennesker8. En nylig studie har identifisert flere gener som har lignende cellulære veier i både morkaken og hjertet. Hvis de forstyrres, kan disse veiene forårsake defekter i begge organer9. Manglene i morkaken kan forverre medfødte hjertefeil. Rollen som placenta genetikk og funksjon på spesifikke fosterorgansystem utvikling er et fremvoksende fagområde.
Mus har hemokorial placentas og andre funksjoner i menneskelige placentas, noe som gjør dem svært nyttige modeller for å studere menneskelig sykdom1. Til tross for morkakens betydning, er det for tiden mangel på målrettede in vivo genetiske manipulasjoner. Videre er det for tiden flere alternativer tilgjengelig for knockouts eller knockdowns enn overexpression eller gain-of-function manipulasjoner i morkaken10. Det er flere transgene Cre-uttrykkende linjer for placental-spesifikk manipulasjon, hver i forskjellige trofoblastlinjer på forskjellige tidspunkter. Disse inkluderer Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER og Gcm1-Cre11,12,13,14. Selv om disse Cre-transgenene er effektive, kan de ikke være i stand til å manipulere noen gener på bestemte tidspunkter. En annen vanlig metode for å enten slå ut eller overuttrykke placenta-genuttrykk er innsetting av lentivirale vektorer i blastocystkultur, noe som forårsaker en trofoblastspesifikk genetisk manipulasjon15,16. Denne teknikken muliggjør en robust endring i placentagenuttrykket tidlig i utviklingen. Bruken av RNA-interferens in vivo har vært lite brukt i morkaken. Innsetting av shRNA-plasmider kan utføres på samme måte som CRIPSR-teknikken beskrevet i denne artikkelen. Dette har blitt gjort ved E13.5 for å lykkes med å redusere PlGF-uttrykk i morkaken, med innvirkning på avkoms hjernevaskulatur17.
I tillegg til teknikker som primært brukes til knockout eller knockdown, utføres induserende overekspresjon ofte med adenovirus eller innsetting av et eksogent protein. Teknikkene som brukes til overuttrykk har varierende grad av suksess og har for det meste blitt utført senere i svangerskapet. For å undersøke rollen til insulinlignende vekstfaktor 1 (IGF-1) i placentafunksjonen, ble det utført en adenoviralmediert placenta-genoverføring for å indusere overekspresjon av IGF-1-genet 18,19. Dette ble utført sent i musesvangerskapet på E18.5 via direkte placentainjeksjon. For å gi flere alternativer og omgå mulige feil i etablerte placentagenetiske manipulasjoner, for eksempel Cre-Lox-kombinasjonsfeil, mulig toksisitet av adenovirus og off-target effekter av shRNA, in vivo direkte CRISPR-manipulering av morkaken kan brukes20,21,22. Denne modellen ble utviklet for å adressere mangelen på overuttrykksmodeller og for å skape en modell med fleksibilitet.
Denne teknikken er basert på arbeidet til Lecuyer et al., der shRNA- og CRISPR-plasmider ble målrettet direkte in vivo til museplacentas for å endre PlGF-uttrykk 17. Denne teknikken kan brukes til å direkte endre placenta-genuttrykk ved hjelp av CRISPR-manipulering på flere tidspunkter; For dette arbeidet ble E12.5 valgt. Morkaken har modnet på dette tidspunktet og er stor nok til å manipulere, noe som gjør det mulig å sette inn et spesifikt CRISPR-plasmid på E12.5, som kan ha en betydelig innvirkning på fosterutviklingen fra midten til slutten av svangerskapet23,24. I motsetning til transgene tilnærminger, men ligner på virale induksjoner eller RNA-interferens, tillater denne teknikken overekspresjon eller knockout på bestemte tidspunkter ved hjelp av en relativt avansert kirurgisk tilnærming, og unngår dermed mulig nedsatt placentasjon eller embryonal dødelighet fra tidligere endringer. Siden bare noen få morkaker mottar eksperimentelt eller kontrollplasmid i et kull, tillater tilnærmingen to typer interne kontroller. Disse kontrollene er de som injiseres og elektroporeres med riktig kontrollplasmid og de som ikke mottar direkte manipulasjon. Denne teknikken ble optimalisert for å skape et overuttrykk av IGF-1-genet i musemorkaken via et synergistisk aktiveringsmediator (SAM) CRISPR-plasmid. Den IGF-1 genet ble valgt, som IGF-1 er et essensielt veksthormon levert til fosteret som primært produseres i morkaken før fødselen25,26. Denne nye placental-målrettede CRISPR-teknikken vil tillate direkte manipulering for å bidra til å definere sammenhengen mellom placentafunksjon og fosterutvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Morkaken er en primær regulator av fostervekst, og som tidligere nevnt kan endringer i morkakens genuttrykk eller funksjon påvirkefosterutviklingen betydelig. Protokollen som er skissert her kan brukes til å utføre en målrettet in vivo CRISPR-manipulering av musemorkaken ved hjelp av en relativt avansert kirurgisk tilnærming. Denne teknikken muliggjør et betydelig utbytte av levedyktige embryoer og deres tilsvarende placentas som kan brukes til videre studier (…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner følgende finansieringskilder: R01 MH122435, NIH T32GM008629 og NIH T32GM145441. Forfatterne takker Dr. Val Sheffield og Dr. Calvin Carters laboratorier ved University of Iowa for bruken av deres operasjonsrom og utstyr, samt Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan og Dr. Matthew Weber for deres hjelp med mikroskopi. Forfatterne takker også Dr. Sara Maurer, Maya Evans og Sreelekha Kundu for deres hjelp med pilotoperasjonene.
Materials
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD – Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 – 44 – 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂ |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24×60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD – Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
References
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
- Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
- Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
