Mus In Vivo placenta riktad CRISPR-manipulation
Summary
Här beskrivs en tidsspecifik metod för att effektivt manipulera kritiska utvecklingsvägar i musens moderkaka in vivo. Detta utförs genom injektion och elektroporering av CRISPR-plasmider i moderkakan hos dräktiga moderdjur på embryonal dag 12,5.
Abstract
Placentan är ett viktigt organ som reglerar och upprätthåller däggdjursutveckling i livmodern. Placentan är ansvarig för överföring av näringsämnen och avfall mellan modern och fostret och produktion och leverans av tillväxtfaktorer och hormoner. Placenta genetiska manipuleringar hos möss är avgörande för att förstå placentans specifika roll i prenatal utveckling. Placentaspecifika Cre-uttryckande transgena möss har varierande effektivitet, och andra metoder för placenta genmanipulation kan vara användbara alternativ. Denna artikel beskriver en teknik för att direkt förändra placentagenuttryck med hjälp av CRISPR-genmanipulation, som kan användas för att modifiera uttrycket av riktade gener. Med hjälp av ett relativt avancerat kirurgiskt tillvägagångssätt genomgår gravida mödrar en laparotomi på embryonal dag 12,5 (E12,5), och en CRISPR-plasmid levereras av en glasmikropipett i de enskilda placentorna. Plasmiden elektroporeras omedelbart efter varje injektion. Efter moderkakans återhämtning kan moderkakan och embryona fortsätta utvecklas fram till bedömningen vid en senare tidpunkt. Utvärderingen av moderkakan och avkomman efter användning av denna teknik kan bestämma rollen som tidsspecifik placentafunktion i utvecklingen. Denna typ av manipulation kommer att möjliggöra en bättre förståelse för hur placenta genetik och funktion påverkar fostrets tillväxt och utveckling i flera sjukdomssammanhang.
Introduction
Placentan är ett viktigt organ som är involverat i fostrets utveckling. Placentans huvudroll är att tillhandahålla väsentliga faktorer och reglera överföringen av näringsämnen och avfall till och från fostret. Däggdjursplacenta består av både foster- och modervävnad, som utgör gränssnittet mellan foster och moder, och därmed genetiken hos både moder- och fostrets påverkansfunktion1. Genetiska anomalier eller nedsatt funktion hos moderkakan kan drastiskt förändra fostrets utveckling. Tidigare forskning har visat att placentagenetik och utveckling är förknippade med den förändrade utvecklingen av specifika organsystem hos fostret. Särskilt avvikelser i moderkakan är kopplade till förändringar i fostrets hjärna, hjärta och kärlsystem 2,3,4,5.
Transporten av hormoner, tillväxtfaktorer och andra molekyler från moderkakan till fostret spelar en viktig roll i fostrets utveckling6. Det har visats att förändring av placentaproduktionen av specifika molekyler kan förändra neurodevelopment. Maternal inflammation kan öka produktionen av serotonin genom att förändra tryptofan (TRP) metaboliskt genuttryck i moderkakan, vilket därefter skapar en ansamling av serotonin i fostrets hjärna7. Andra studier har funnit placenta abnormiteter tillsammans med hjärtfel. Avvikelser i moderkakan tros bidra till medfödda hjärtfel, den vanligaste fosterskadan hos människor8. En ny studie har identifierat flera gener som har liknande cellulära vägar i både moderkakan och hjärtat. Om de störs kan dessa vägar orsaka defekter i båda organen9. Defekterna i moderkakan kan förvärra medfödda hjärtfel. Placentagenetikens och funktionens roll på utvecklingen av specifika fosterorgansystem är ett framväxande studieområde.
Möss har hemokorial placenta och andra egenskaper hos mänskliga placentor, vilket gör dem mycket användbara modeller för att studera mänsklig sjukdom1. Trots placentans betydelse saknas det för närvarande riktade genetiska manipulationer in vivo. Dessutom finns det för närvarande fler alternativ tillgängliga för knockouts eller knockdowns än överuttryck eller gain-of-function-manipulationer i placenta10. Det finns flera transgena Cre-uttryckande linjer för placentaspecifik manipulation, var och en i olika trofoblastlinjer vid olika tidpunkter. Dessa inkluderar Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER och Gcm1-Cre11,12,13,14. Även om dessa Cre-transgener är effektiva, kanske de inte kan manipulera vissa gener vid specifika tidpunkter. En annan vanlig metod för att antingen knockout eller överuttrycka placentagenuttryck är införandet av lentivirala vektorer i blastocystkulturen, vilket orsakar en trofoblastspecifik genetisk manipulation15,16. Denna teknik möjliggör en robust förändring i placentagenuttrycket tidigt i utvecklingen. Användningen av RNA-interferens in vivo har utnyttjats sparsamt i moderkakan. Införandet av shRNA-plasmider kan utföras på samma sätt som CRIPSR-tekniken som beskrivs i detta dokument. Detta har gjorts vid E13.5 för att framgångsrikt minska PlGF-uttrycket i moderkakan, med effekter på avkommans hjärnkärl17.
Förutom tekniker som främst används för knockout eller knockdown, induceras överuttryck vanligen med adenovirus eller införandet av ett exogent protein. De tekniker som används för överuttryck har varierande framgångsgrad och har mestadels utförts senare under graviditeten. För att undersöka rollen av insulinliknande tillväxtfaktor 1 (IGF-1) i placentafunktionen utfördes en adenoviralmedierad placentagenöverföring för att inducera överuttryck av IGF-1-genen 18,19. Detta utfördes sent i musdräktighet på E18.5 via direkt placentainjektion. För att tillhandahålla ytterligare alternativ och kringgå eventuella misslyckanden av etablerade placenta genetiska manipulationer, såsom Cre-Lox-kombinationsfel, adenovirusens möjliga toxicitet och off-target-effekterna av shRNA, kan in vivo direkt CRISPR-manipulation av moderkakan användas20,21,22. Denna modell utvecklades för att ta itu med bristen på överuttrycksmodeller och för att skapa en modell med flexibilitet.
Denna teknik är baserad på Lecuyer et al., där shRNA- och CRISPR-plasmider riktades direkt in vivo mot musplacenta för att förändra PlGF-uttryck 17. Denna teknik kan användas för att direkt förändra placenta genuttryck med hjälp av CRISPR-manipulation vid flera tidpunkter; för detta arbete valdes E12.5. Placentan har mognat vid denna tidpunkt och är tillräckligt stor för att manipulera, vilket möjliggör införandet av en specifik CRISPR-plasmid på E12.5, vilket kan ha en betydande inverkan på fostrets utveckling från mitten till sen graviditet23,24. Till skillnad från transgena metoder, men liknande virala induktioner eller RNA-interferens, möjliggör denna teknik överuttryck eller knockout vid vissa tidpunkter med hjälp av ett relativt avancerat kirurgiskt tillvägagångssätt, vilket undviker eventuell försämrad placentation eller embryonal dödlighet från tidigare förändringar. Eftersom endast ett fåtal placenta tar emot experimentell plasmid eller kontrollplasmid i en kull, möjliggör tillvägagångssättet två typer av interna kontroller. Dessa kontroller är de som injiceras och elektroporeras med lämplig kontrollplasmid och de som inte får någon direkt manipulation. Denna teknik optimerades för att skapa ett överuttryck av IGF-1-genen i musmoderkakan via en synergistisk aktiveringsmediator (SAM) CRISPR-plasmid. IGF-1-genen valdes, eftersom IGF-1 är ett viktigt tillväxthormon som levereras till fostret som främst produceras i moderkakan före födseln25,26. Denna nya placenta-riktade CRISPR-teknik kommer att möjliggöra direkt manipulation för att definiera sambandet mellan placentafunktion och fosterutveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Placentan är en primär regulator för fostrets tillväxt, och som tidigare nämnts kan förändringar i placenta genuttryck eller funktion väsentligt påverka fostrets utveckling6. Protokollet som beskrivs här kan användas för att utföra en riktad in vivo CRISPR-manipulation av musmoderkakan med hjälp av ett relativt avancerat kirurgiskt tillvägagångssätt. Denna teknik möjliggör ett betydande utbyte av livskraftiga embryon och deras motsvarande placenta som kan användas för…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner följande finansieringskällor: R01 MH122435, NIH T32GM008629 och NIH T32GM145441. Författarna tackar Dr. Val Sheffield och Dr. Calvin Carters laboratorier vid University of Iowa för användningen av deras operationsrum och utrustning, liksom Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan och Dr. Matthew Weber för deras hjälp med mikroskopi. Författarna tackar också Dr. Sara Maurer, Maya Evans och Sreelekha Kundu för deras hjälp med pilotoperationerna.
Materials
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD – Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 – 44 – 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂ |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24×60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD – Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
References
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
- Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
- Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
