In vitro myelinering af perifere axoner i en samkultur af rotte, dorsalrod, ganglioneksplanter og Schwann-celler

Summary

I samkultursystemet af dorsale rodganglier og Schwann-celler kan myelinering af det perifere nervesystem undersøges. Denne model giver eksperimentelle muligheder for at observere og kvantificere perifer myelinering og studere virkningerne af forbindelser af interesse på myelinskeden.

Abstract

Myelineringsprocessen er afgørende for at muliggøre hurtig og tilstrækkelig signaltransduktion i nervesystemet. I det perifere nervesystem engagerer neuroner og Schwann-celler sig i en kompleks interaktion for at kontrollere myelinering af axoner. Forstyrrelser af denne interaktion og nedbrydning af myelinskeden er kendetegnende for inflammatoriske neuropatier og forekommer sekundært i neurodegenerative lidelser. Her præsenterer vi en samkulturmodel af dorsalrodganglioneksplanter og Schwann-celler, som udvikler en robust myelinering af perifere axoner for at undersøge myelineringsprocessen i det perifere nervesystem, studere axon-Schwann-celleinteraktioner og evaluere de potentielle virkninger af terapeutiske midler på hver celletype separat. Metodisk blev dorsale rodganglioner af embryonale rotter (E13.5) høstet, adskilt fra deres omgivende væv og dyrket som hele eksplanter i 3 dage. Schwann-celler blev isoleret fra 3 uger gamle voksne rotter, og iskiasnerverne blev enzymatisk fordøjet. De resulterende Schwann-celler blev renset ved magnetisk aktiveret cellesortering og dyrket under neuregulin- og forskolin-berigede betingelser. Efter 3 dages dorsal rodganglion explant kultur blev 30.000 Schwann-celler tilsat til en dorsal rodganglion explant i et medium indeholdende ascorbinsyre. De første tegn på myelinisering blev påvist på dag 10 af cokultur gennem spredte signaler for myelinbasisk protein i immunocytokemisk farvning. Fra dag 14 og fremefter blev myelinskeder dannet og formeret langs axonerne. Myelinering kan kvantificeres ved myelinbasisk proteinfarvning som et forhold mellem myelineringsområdet og axonarealet for at tage højde for forskellene i aksonal densitet. Denne model giver eksperimentelle muligheder for at studere forskellige aspekter af perifer myelinering in vitro, hvilket er afgørende for at forstå patologien og mulige behandlingsmuligheder for demyelinering og neurodegeneration i inflammatoriske og neurodegenerative sygdomme i det perifere nervesystem.

Introduction

I det perifere nervesystem (PNS) medieres hurtig informationstransduktion af myelinindpakkede axoner. Myelinering af axoner er afgørende for at muliggøre hurtig udbredelse af elektriske impulser, da ledningshastigheden af nervefibrene korrelerer med axondiameteren og myelintykkelsen¹. Sensorisk signalering fra periferien til centralnervesystemet (CNS) er afhængig af aktiveringen af førsteordens sensoriske neuroner, der befinder sig i udvidelser af dorsalroden, kaldet dorsale rodganglier (DRG). Til dannelse og vedligeholdelse af myelin er kontinuerlig kommunikation mellem axoner og Schwann-celler, som er de myeliniserende gliaceller i PNS, obligatorisk².

Mange sygdomme i PNS forstyrrer transduktionen af information ved enten primær aksonal eller demyeliniserende skade, hvilket resulterer i hypestesi eller dysestesi. Førsteordens sensoriske neuroner har evnen til at regenerere i et omfang efter neuronal skade ved en kompleks interaktion mellem neuronen og omgivende Schwann-celler³. I dette tilfælde kan Schwann-celler gennemgå cellulær omprogrammering for at rydde aksonalt såvel som myelinaffald og fremme aksonal regenerering, hvilket resulterer i remyelinering⁴. Det er vigtigt at forstå mekanismerne for myelinering i sundhed og sygdom for at finde mulige behandlingsmuligheder for demyeliniserende lidelser i PNS. Myelin kan også blive beskadiget af akut neurotrauma, og tilgange til at fremme myelinering for at fremme funktionel genopretning efter perifer nerveskade er under undersøgelse⁵.

Vores viden om perifer myelinering har i høj grad haft gavn af myeliniserende cokulturer af Schwann-celler og sensoriske neuroner. Siden de første metoder blev anvendt ^6,7,8, er myelinering blevet undersøgt intenst ved brug af forskellige samkultursystemer^9,10,11. Her leverer vi en hurtig og let protokol til robust in vitro myelinering af dorsale rodganglionaxoner. Protokollen for Schwann-celleforberedelse er baseret på protokollen af Andersen et al.12, tidligere offentliggjort i Pitarokoili et ^al.13. Vi bruger Schwann-celler fra unge rotter og embryonale DRG-eksplantatkulturer til samkulturen, hvor myelinering forekommer omkring dag 14. Målet med metoden er at tilvejebringe et system til at undersøge dannelsen af myelin som følge af direkte axon-Schwann-celleinteraktion og at studere modulatorer af PNS-myelinisering. I sammenligning med dissocierede neuronale cellekulturer er DRG-eksplanter mere anatomisk bevaret og danner lange aksonale processer. Kvantificering af det myelinerede axonområde giver en tilstrækkelig aflæsning til myelinering i samkulturen. Metoden er et værdifuldt værktøj til at screene terapeutiske forbindelser for deres potentielle virkning på PNS-myelinering og kan også anvendes som supplement til in vivo-undersøgelser i dyremodeller¹⁴.

Protocol

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers rådsdirektiv om pasning og anvendelse af forsøgsdyr. 1. Schwann-cellekultur Belægning til Schwann-cellekulturOvertræk cellekulturskålene under sterile forhold. Påfør 2 ml 0,01% poly-L-lysin (PLL) på to 60 mm vævskultur (TC) skåle hver og inkuber natten over ved 4 °C. PLL’en fjernes, TC-skålene vaskes 2x med destilleret vand, og der inkuberes med 2 ml 1 μg…

Representative Results

Myelinering i samkulturen blev vurderet på dag 10, 12, 14, 16, 18 og 20. DRG-eksplanterne og Schwann-cellerne blev farvet for MBP, βIII-tubulin og DAPI. Det aksonale netværk i samkulturen var tæt og ændrede sig ikke synligt i observationsforløbet. De første tegn på myelin, i form af små fragmenter, kunne påvises på dag 10 og steg på dag 12 (figur 2). De MBP-positive områder steg over tid indtil dag 20 af kulturen. Myeliniseringen blev kvantificeret som forholdet mellem MBP- og ?…

Discussion

Her præsenterer vi en hurtig og let protokol til generering af de vitro-myelinering ved at fusionere to separate celletypekulturer, Schwann-celler og dorsalrodganglion-eksplanter.

Et kritisk trin i protokollen er dyrkning af DRG-eksplanter, især i de første dage af kulturen. DRG er meget skrøbelige, før et stærkt aksonalt netværk er bygget og skal håndteres meget omhyggeligt, for eksempel når de tages ud af inkubatoren eller under skift af medium. DRG, der løsner sig fra bun…

Materials

Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285