מיאלינציה חוץ גופית של אקסונים היקפיים בתרבות משותפת של שורשי חולדה, גנגליון גבי, צמחים ותאי שוואן

Summary

במערכת ההתרבות המשותפת של גרעיני השורש הגבי ותאי Schwann, ניתן ללמוד מיאלינציה של מערכת העצבים ההיקפית. מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות לצפות ולכמת את המיאלינציה ההיקפית ולחקור את ההשפעות של תרכובות ריבית על מעטפת המיאלין.

Abstract

תהליך המיאלינציה חיוני כדי לאפשר העברת אותות מהירה ומספקת במערכת העצבים. במערכת העצבים ההיקפית, נוירונים ותאי Schwann עוסקים באינטראקציה מורכבת כדי לשלוט במיאלינציה של אקסונים. הפרעות של אינטראקציה זו והתמוטטות של נדן המיאלין הם סימני היכר של נוירופתיות דלקתיות ומתרחשות באופן משני בהפרעות נוירודגנרטיביות. כאן, אנו מציגים מודל קוקולטורה של צמחי גנגליון שורש גבי ותאי Schwann, אשר מפתח מיאלינציה חזקה של אקסונים היקפיים כדי לחקור את תהליך המיאלינציה במערכת העצבים ההיקפית, לחקור אינטראקציות בין תאי אקסון-שוואן ולהעריך את ההשפעות האפשריות של חומרים טיפוליים על כל סוג תא בנפרד. מבחינה מתודולוגית, גנגליונים של שורש גבי של חולדות עובריות (E13.5) נקטפו, נותקו מהרקמה הסובבת אותם, ותורבתו כצמחים שלמים במשך 3 ימים. תאי Schwann בודדו מחולדות בוגרות בנות 3 שבועות, ועצבים סיאטיים עוכלו אנזימטית. תאי Schwann שהתקבלו טוהרו על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית וגודלו בתרבית בתנאים מועשרים בנוירגולין ובפורסקולין. לאחר 3 ימים של תרבית גנגליון שורש גבי, נוספו 30,000 תאי Schwann לצמח גנגליון שורש גבי אחד בתווך המכיל חומצה אסקורבית. הסימנים הראשונים של מיאלינציה התגלו ביום ה-10 של התרבות המשותפת, באמצעות אותות מפוזרים לחלבון בסיסי של מיאלין בצביעה אימונוציטוכימית. מהיום ה-14 ואילך נוצרו נדני המיאלין והתפשטו לאורך האקסונים. ניתן לכמת את המיאלינציה על ידי צביעת חלבון בסיסי במיאלין כיחס בין אזור המיאלינציה לאזור האקסון, כדי להסביר את ההבדלים בצפיפות האקסונלית. מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות לחקור היבטים שונים של מיאלינציה היקפית במבחנה, שהיא חיונית להבנת הפתולוגיה של והזדמנויות טיפול אפשריות לדמיאלינציה וניוון עצבי במחלות דלקתיות וניווניות של מערכת העצבים ההיקפית.

Introduction

במערכת העצבים ההיקפית (PNS), העברת מידע מהירה מתווכת על ידי אקסונים עטופים במיאלין. המיאלינציה של אקסונים חיונית כדי לאפשר התפשטות מהירה של דחפים חשמליים, שכן מהירות ההולכה של סיבי העצב מתואמת לקוטר האקסון ועובי המיאלין¹. איתות חושי מהפריפריה למערכת העצבים המרכזית (CNS) מסתמך על הפעלה של נוירונים חושיים מסדר ראשון השוכנים בהגדלות של השורש הגבי, המכונים גרעיני שורש גבי (DRG). עבור היווצרות ותחזוקה של מיאלין, תקשורת רציפה בין אקסונים ותאי Schwann, שהם תאי Glia myelinating ב- PNS, היא חובה².

מחלות רבות של מערכת העצבים הפארא-סימפתאית מפריעות להתמרה של מידע על-ידי נזק אקסונלי ראשוני או דמיאלינטינג, וכתוצאה מכך להיפסטזיה או דיססתזיה. לנוירונים חושיים מסדר ראשון יש את היכולת להתחדש במידה מסוימת לאחר נזק עצבי, על ידי אינטראקציה מורכבת בין תא העצב לבין תאי שוואן הסובבים אותו³. במקרה זה, תאי Schwann יכולים לעבור תכנות מחדש של תאים כדי לנקות פסולת אקסונלית כמו גם מיאלין ולקדם התחדשות אקסונלית, וכתוצאה מכך רמיאלינציה⁴. הבנת מנגנוני המיאלינציה בבריאות ובמחלות חשובה, על מנת למצוא אפשרויות טיפול אפשריות להפרעות דה-מיאלינציה של מערכת העצבים הפארא-סימפתטית. מיאלין יכול להיפגע גם על ידי נוירוטראומה חריפה, וגישות לקידום מיאלינציה לקידום התאוששות תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית נמצאות תחת חקירה⁵.

הידע שלנו על מיאלינציה היקפית הפיק תועלת רבה מתרביות מיאלינטיות של תאי Schwann ונוירונים חושיים. מאז הגישות הראשונות יושמו ^6,7,8, myelination נחקר באופן אינטנסיבי עם שימוש במערכות coculture שונות^9,10,11. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מהיר וקל עבור myelination in vitro חזק של אקסונים גנגליון שורש גבי. הפרוטוקול להכנת תאי Schwann מבוסס על הפרוטוקול של Andersen et al.12, שפורסם בעבר ב-Pitarokoili et ^al.13. אנו משתמשים בתאי Schwann שמקורם בחולדות צעירות ובתרביות DRG עובריות עבור התרבות המשותפת, שבה המיאלינציה מתרחשת בסביבות היום ה-14. מטרת השיטה היא לספק מערכת שתחקור את היווצרות המיאלין כתוצאה מאינטראקציה ישירה בין תאי אקסון-שואן, ולחקור מודולטורים של מיאלינציה של מערכת העצבים הפארא-סימפתטית. בהשוואה לתרביות תאים עצביים מנותקים, צמחי DRG נשמרים יותר אנטומית ויוצרים תהליכים אקסונליים ארוכים. כימות של אזור האקסון המיאלינטי מספק קריאה מספקת למיאלינציה בקוקולטור. השיטה היא כלי רב ערך לסינון תרכובות טיפוליות עבור השפעתן הפוטנציאלית על מיאלינציה של מערכת העצבים הפאראסימפת-דלקתית, וניתן להשתמש בה גם בנוסף למחקרי in vivo במודלים של בעלי חיים¹⁴.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם לדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. 1. תרבית תאי Schwann ציפוי לתרבית תאי Schwannמצפים את כלי תרבית התאים בתנאים סטריליים. יש למרוח 2 מ”ל של 0.01% פולי-ל-ליזין (PLL) על שתי מנות תרבית רקמה (TC) בקוטר 60 מ”מ כל אחת ולדגור למש?…

Representative Results

המיאלינציה בתרבות המשותפת הוערכה בימים 10, 12, 14, 16, 18 ו-20. צמחי DRG ותאי Schwann הוכתמו עבור MBP, βIII-tubulin ו- DAPI. הרשת האקסונלית בקוקולטורה הייתה צפופה ולא השתנתה באופן ניכר במהלך הזמן של התצפית. הסימנים הראשונים של מיאלין, בצורה של שברים קטנים, היו ניתנים לזיהוי ביום ה-10 והתגברו ביום ה-12 (איו…

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מהיר וקל ליצירת מיאלינציה חוץ גופית על ידי מיזוג שתי תרביות נפרדות מסוג תאים, תאי Schwann וצמחי גנגליון שורש גבי.

שלב קריטי בפרוטוקול הוא גידול צמחי DRG, במיוחד בימים הראשונים של התרבות. DRG הם שבירים מאוד לפני בניית רשת אקסונלית חזקה ויש לטפל בהם בזהי?…

Materials

Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285