Dans le système de coculture des ganglions de la racine dorsale et des cellules de Schwann, la myélinisation du système nerveux périphérique peut être étudiée. Ce modèle offre des possibilités expérimentales d’observer et de quantifier la myélinisation périphérique et d’étudier les effets des composés d’intérêt sur la gaine de myéline.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Myélinisation in vitro d’axones périphériques dans une coculture d’explants de ganglions radiculaires dorsaux de rat et de cellules de Schwann
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le processus de myélinisation est essentiel pour permettre une transduction rapide et suffisante du signal dans le système nerveux. Dans le système nerveux périphérique, les neurones et les cellules de Schwann s’engagent dans une interaction complexe pour contrôler la myélinisation des axones. Les perturbations de cette interaction et la dégradation de la gaine de myéline sont caractéristiques des neuropathies inflammatoires et surviennent secondairement dans les troubles neurodégénératifs. Ici, nous présentons un modèle de coculture d’explants ganglionnaires de la racine dorsale et de cellules de Schwann, qui développe une myélinisation robuste des axones périphériques pour étudier le processus de myélinisation dans le système nerveux périphérique, étudier les interactions axones-cellules de Schwann et évaluer les effets potentiels des agents thérapeutiques sur chaque type de cellule séparément. Méthodologiquement, les ganglions radiculaires dorsaux de rats embryonnaires (E13.5) ont été récoltés, dissociés de leurs tissus environnants et cultivés comme explants entiers pendant 3 jours. Les cellules de Schwann ont été isolées chez des rats adultes âgés de 3 semaines et les nerfs sciatiques ont été digérés par voie enzymatique. Les cellules de Schwann résultantes ont été purifiées par tri cellulaire activé magnétiquement et cultivées dans des conditions enrichies en neuréguline et en forskoline. Après 3 jours de culture d’explantation de ganglions de la racine dorsale, 30 000 cellules de Schwann ont été ajoutées à un ganglion de la racine dorsale explant dans un milieu contenant de l’acide ascorbique. Les premiers signes de myélinisation ont été détectés au jour 10 de la coculture, par des signaux diffusés pour la protéine basique de la myéline dans la coloration immunocytochimique. À partir du jour 14, des gaines de myéline se sont formées et se sont propagées le long des axones. La myélinisation peut être quantifiée par coloration des protéines basiques de la myéline en tant que rapport de l’aire de myélinisation et de la zone axonale, pour tenir compte des différences de densité axonale. Ce modèle offre des possibilités expérimentales d’étudier divers aspects de la myélinisation périphérique in vitro, ce qui est crucial pour comprendre la pathologie et les possibilités de traitement de la démyélinisation et de la neurodégénérescence dans les maladies inflammatoires et neurodégénératives du système nerveux périphérique.
Introduction
Dans le système nerveux périphérique (SNP), la transduction rapide de l’information est médiée par des axones enveloppés de myéline. La myélinisation des axones est essentielle pour permettre la propagation rapide des impulsions électriques, puisque la vitesse de conduction des fibres nerveuses est corrélée au diamètre de l’axone et à l’épaisseur de la myéline1. La signalisation sensorielle de la périphérie au système nerveux central (SNC) repose sur l’activation de neurones sensoriels de premier ordre qui résident dans des élargissements de la racine dorsale, appelés ganglions de la racine dorsale (DRG). Pour la formation et le maintien de la ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la Directive du Conseil des Communautés européennes sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Culture cellulaire de Schwann
- Enrobage pour culture cellulaire Schwann
- Enduire les boîtes de culture cellulaire dans des conditions stériles. Appliquer 2 mL de poly-L-lysine (PLL) à 0,01 % sur deux boîtes de culture tissulaire (TC) de 60 mm chacune et incuber pendant une nuit à 4 °C.
- Retirer la LPL, laver les plats TC 2x avec de l’eau distillée et incuber avec 2 mL de 1 μg/cm2 de laminine pendant une nuit à 4 °C. Lavez ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La myélinisation dans la coculture a été évaluée aux jours 10, 12, 14, 16, 18 et 20. Les explants DRG et les cellules de Schwann ont été colorés pour le MBP, la βIII-tubuline et le DAPI. Le réseau axonal dans la coculture était dense et n’a pas changé visiblement au cours de l’observation. Les premiers signes de myéline, sous forme de petits fragments, étaient détectables au jour 10 et ont augmenté au jour 12 (figure 2). Les zones positives pour le MBP ont augmenté au fil du temps jusqu’au j.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Ici, nous présentons un protocole rapide et facile pour la génération de myélinisation in vitro en fusionnant deux cultures de type cellulaire distinctes, les cellules de Schwann et les explants ganglionnaires de la racine dorsale.
Une étape critique du protocole est la culture d’explants DRG, en particulier dans les premiers jours de culture. Les DRG sont très fragiles avant la construction d’un réseau axonal fort et doivent être manipulés avec beaucoup de précaution, par exemple lor.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions le Prof. Dr. Ralf Gold et la Dr. Gisa Ellrichmann pour leurs conseils et leur soutien.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Anti-MBP, lapin | Novus Biologicals, Centannial, États-Unis | ABIN446360 | |
| Anti-ß ; III-tubuline, souris ; | Biolegend, San Diego, États-Unis | 657402 | |
| Acide ascorbique ; | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne ; | A4403-100MG | |
| Supplément de B27 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne ; | 17504-044 | |
| Pointe de filtre Biosphere, 100 & micro ; L | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| Pointe filtrante Biosphere, 1250 & micro ; L | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| Pointe de filtre Biosphere, 20 & micro ; L | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| Pointe de filtre Biosphere, 300 & micro ; L | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| Albumine sérique bovine | Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne ; | 8076.4 | |
| Crépine à cellules, 100 & micro ; M | BD Bioscience, Heidelberg, Allemagne | 352360 | |
| Centrifugeuse 5810-R | Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne | 5811000015 | |
| Incubateur CO2 Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Allemagne ; | ||
| lamelles 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne ; | P231.1 | |
| Pince fine courbe. | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Allemagne | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne ; | ||
| Eau distillée (système de purification de l’eau) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne. | ||
| DPBS (pas de Ca2+ et pas de Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne. | D8537-6X500ML | |
| Éthanol ; | VWR, Radnor, États-Unis ; | ||
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne. | F7524 | FCS doit être testé pour la culture cellulaire Schwann |
| Pinces fines (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne ; | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne ; | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne | 5710064 | |
| IgG anti-souris de chèvre Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne ; | A11036 | |
| Chèvre anti-lapin IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne ; | A11001 | |
| HBSS (sans Ca2+ et sans Mg2+) ; | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne ; | ||
| incubateur HERAcell | Heraeus Instruments, Hanau, Allemagne. | ||
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne. | ||
| Sérum de cheval | Pan-Biotech, Aidenbach, Allemagne | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, États-Unis | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne ; | L2020-1MG | |
| Leibovitz´ ; s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne ; | ||
| L-Glutamine 200 mM² | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne ; | ||
| MACS Multistand ; | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne | 15000-08 | |
| Microscope ; | Motic, Wetzlar, Allemagne | Microscope Motic BA 400 | |
| Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Allemagne ; | 491917-0001-000 | |
| Lame de microscope | VWR, Radnor, États-Unis ; | 630-1985 | |
| Séparateur MiniMACS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130091632 | |
| colonnes MS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-042-201 | |
| Chambre de comptage Neubauer ; | Assistante, Erlangen, Allemagne | 40441 ; | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, États-Unis | 100-03 | |
| Milieu neurobasal ; | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne ; | ||
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne. | N1408 | |
| Sérum de chèvre normal | Biozol, Eching, Allemagne | S-1000 | |
| Nunclon &Delta ; paraboles, 4 puits | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne ; | D6789 | |
| Paraformaldéhyde | Acros Organics, New Jersey, États-Unis. | ||
| Pénicilline/Streptomycine | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne ; | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne | 4430000018 ; | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne ; | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne ; | P4707-50ML | |
| Tubes à réaction, 15 ; mL | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| Tubes à réaction, 50 mL | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| Récipients de réaction, 1,5 mL | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| 72690001 Armoire de sécurité S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne ; | ||
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne | 14083-08 | |
| Pipette sérologique, 10 mL | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| Pipette sérologique, 25 mL | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| Pipette sérologique, 5 mL | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne | 10094-13 | |
| Stéréomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Allemagne ; | 495015-0012-000 ; | |
| Ciseaux chirurgicaux | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne | 14007-14 | |
| TC parabole 100, cellule + | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| Antenne TC 35, cellule + | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| Antenne TC 60, cellule + | Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne ; | ||
| 833901300 Microbilles Thy-1 (kit MACS) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-094-523 | |
| Triton X-100 ; | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne ; | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0,4 % ; | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne ; | ||
| Trypsine (2,5 %), sans rouge de phénol | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne ; | 15090-046 | |
| Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne ; | 25300-054 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich de type I GmbH, Steinheim, Allemagne ; | C1639 | |
| Bain-marie type 1008 | GFL, Burgwedel, Allemagne ; | 4285 |
Références
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
