Mielinizzazione in vitro di assoni periferici in una cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale di ratto e cellule di Schwann

Summary

Nel sistema di cocoltura dei gangli della radice dorsale e delle cellule di Schwann, può essere studiata la mielinizzazione del sistema nervoso periferico. Questo modello offre opportunità sperimentali per osservare e quantificare la mielinizzazione periferica e per studiare gli effetti dei composti di interesse sulla guaina mielinica.

Abstract

Il processo di mielinizzazione è essenziale per consentire una rapida e sufficiente trasduzione del segnale nel sistema nervoso. Nel sistema nervoso periferico, i neuroni e le cellule di Schwann si impegnano in una complessa interazione per controllare la mielinizzazione degli assoni. I disturbi di questa interazione e la rottura della guaina mielinica sono segni distintivi delle neuropatie infiammatorie e si verificano secondariamente nei disturbi neurodegenerativi. Qui, presentiamo un modello di cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale e cellule di Schwann, che sviluppa una robusta mielinizzazione degli assoni periferici per studiare il processo di mielinizzazione nel sistema nervoso periferico, studiare le interazioni assone-cellule di Schwann e valutare separatamente i potenziali effetti degli agenti terapeutici su ciascun tipo di cellula. Metodologicamente, i gangli delle radici dorsali di ratti embrionali (E13.5) sono stati raccolti, dissociati dal tessuto circostante e coltivati come espianti interi per 3 giorni. Le cellule di Schwann sono state isolate da ratti adulti di 3 settimane e i nervi sciatici sono stati digeriti enzimaticamente. Le cellule di Schwann risultanti sono state purificate mediante selezione cellulare attivata magneticamente e coltivate in condizioni arricchite di neuregulina e forskolina. Dopo 3 giorni di coltura dell’espianto del ganglio della radice dorsale, 30.000 cellule di Schwann sono state aggiunte a un espianto di ganglio della radice dorsale in un mezzo contenente acido ascorbico. I primi segni di mielinizzazione sono stati rilevati il giorno 10 della cocoltura, attraverso segnali sparsi per la proteina basica della mielina nella colorazione immunocitochimica. Dal giorno 14 in poi, le guaine mieliniche si sono formate e propagate lungo gli assoni. La mielinizzazione può essere quantificata dalla colorazione delle proteine basiche della mielina come rapporto tra l’area di mielinizzazione e l’area assone, per tenere conto delle differenze nella densità assonale. Questo modello offre opportunità sperimentali per studiare vari aspetti della mielinizzazione periferica in vitro, che è cruciale per comprendere la patologia e le possibili opportunità di trattamento per la demielinizzazione e la neurodegenerazione nelle malattie infiammatorie e neurodegenerative del sistema nervoso periferico.

Introduction

Nel sistema nervoso periferico (PNS), la rapida trasduzione dell’informazione è mediata da assoni avvolti dalla mielina. La mielinizzazione degli assoni è essenziale per consentire la rapida propagazione degli impulsi elettrici, poiché la velocità di conduzione delle fibre nervose è correlata al diametro dell’assone e allo spessore della mielina¹. La segnalazione sensoriale dalla periferia al sistema nervoso centrale (SNC) si basa sull’attivazione di neuroni sensoriali di primo ordine che risiedono negli allargamenti della radice dorsale, chiamati gangli della radice dorsale (DRG). Per la formazione e il mantenimento della mielina, la comunicazione continua tra assoni e cellule di Schwann, che sono le cellule della glia mielinica nel PNS, è obbligatoria².

Molte malattie del PNS disturbano la trasduzione delle informazioni da parte di danni assonali primari o demielinizzanti, con conseguente ipestesia o disestesia. I neuroni sensoriali di primo ordine hanno la capacità di rigenerarsi in una certa misura dopo il danno neuronale, da una complessa interazione tra il neurone e le cellule di Schwann circostanti³. In questo caso, le cellule di Schwann possono subire una riprogrammazione cellulare per eliminare i detriti assonale e mielinico e promuovere la rigenerazione assonale, con conseguente rimielinizzazione⁴. Comprendere i meccanismi della mielinizzazione nella salute e nella malattia è importante, al fine di trovare possibili opzioni di trattamento per i disturbi demielinizzanti del PNS. La mielina può anche essere danneggiata da neurotraumi acuti e gli approcci per promuovere la mielinizzazione per far avanzare il recupero funzionale dopo la lesione del nervo periferico sono in fase di indagine⁵.

La nostra conoscenza della mielinizzazione periferica ha beneficiato in gran parte delle cocolture mieliniche di cellule di Schwann e neuroni sensoriali. Da quando sono stati applicati i primi approcci ^6,7,8, la mielinizzazione è stata studiata intensamente con l’uso di diversi sistemi di cocoltura 9,10,11. Qui, forniamo un protocollo rapido e semplice per la mielinizzazione in vitro robusta degli assoni del ganglio della radice dorsale. Il protocollo per la preparazione delle cellule di Schwann si basa sul protocollo di Andersen et al.12, precedentemente pubblicato su Pitarokoili et ^al.13. Utilizziamo cellule di Schwann derivate da ratti giovani e colture embrionali di espianti DRG per la cocoltura, in cui la mielinizzazione si verifica intorno al giorno 14. L’obiettivo del metodo è quello di fornire un sistema per studiare la formazione di mielina come risultato dell’interazione diretta assone-cellule di Schwann e di studiare i modulatori della mielinizzazione PNS. Rispetto alle colture cellulari neuronali dissociate, gli espianti di DRG sono più anatomicamente conservati e formano lunghi processi assonali. La quantificazione dell’area dell’assone mielinica fornisce una lettura sufficiente per la mielinizzazione nella cocoltura. Il metodo è uno strumento prezioso per lo screening dei composti terapeutici per il loro potenziale effetto sulla mielinizzazione PNS e può anche essere utilizzato in aggiunta agli studi in vivo in modelli animali¹⁴.

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la direttiva del Consiglio delle Comunità europee per la cura e l’uso di animali da laboratorio. 1. Coltura cellulare di Schwann Rivestimento per coltura cellulare SchwannRivestire i piatti di coltura cellulare in condizioni sterili. Applicare 2 ml di poli-L-lisina (PLL) allo 0,01% su due piatti di coltura tissutale (TC) da 60 mm ciascuno e incubare per una notte a 4 °C. Rimuovere il PLL, …

Representative Results

La mielinizzazione nella cocultura è stata valutata nei giorni 10, 12, 14, 16, 18 e 20. Gli espianti DRG e le cellule di Schwann sono stati colorati per MBP, βIII-tubulina e DAPI. La rete assonale nella cocultura era densa e non cambiava visibilmente nel corso dell’osservazione. I primi segni di mielina, sotto forma di piccoli frammenti, erano rilevabili il giorno 10 e aumentavano il giorno 12 (Figura 2). Le aree MBP-positive sono aumentate nel tempo fino al giorno 20 della cultura. La mie…

Discussion

Qui, presentiamo un protocollo rapido e facile per la generazione di mielinizzazione in vitro fondendo due colture di tipo cellulare separate, cellule di Schwann e espianti di ganglio della radice dorsale.

Un passaggio critico del protocollo è la coltivazione di espianti DRG, soprattutto nei primi giorni di coltura. I DRG sono molto fragili prima che venga costruita una forte rete assonale e devono essere maneggiati con molta attenzione, ad esempio, quando vengono estratti dall’incub…

Materials

Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285