تقنيات وممارسات زراعة الخلايا لتجنب التلوث بالفطريات والبكتيريا في مختبر زراعة الخلايا البحثية
Summary
يقدم هذا البروتوكول تقنيات وممارسات زراعة الخلايا الأساسية لاستخدامها في مختبر زراعة الخلايا البحثية لتجنب التلوث بالفطريات والبكتيريا. ضمن فئة البكتيريا ، سيتم التركيز بشكل خاص على منع تلوث الميكوبلازما.
Abstract
زراعة الخلايا هي مهارة دقيقة ضرورية لزراعة الخلايا البشرية والحيوانية والحشرية ، أو الأنسجة الأخرى ، في بيئة خاضعة للرقابة. الهدف من البروتوكول هو التأكيد على التقنيات الصحيحة المستخدمة في مختبر الأبحاث لمنع التلوث من الفطريات والبكتيريا. يتم التركيز بشكل خاص على تجنب تلوث الميكوبلازما ، وهو مصدر قلق كبير في غرفة زراعة الخلايا نظرا لصغر حجمها ومقاومتها لمعظم المضادات الحيوية المستخدمة في زراعة الخلايا. هذه التقنيات نفسها تضمن النمو المستمر والحفاظ على الخلايا السليمة. بالنسبة لمستخدمي زراعة الخلايا الجدد وذوي الخبرة على حد سواء ، من المهم الالتزام باستمرار بأفضل الممارسات هذه للتخفيف من مخاطر التلوث. مرة واحدة في السنة ، يجب على المختبرات مراجعة أفضل ممارسات زراعة الخلايا والمتابعة بمناقشة أو تدريب إضافي إذا لزم الأمر. إن اتخاذ إجراءات مبكرة لمنع التلوث في المقام الأول سيوفر الوقت والمال ، مقارنة بالتنظيف بعد حدوث التلوث. تحافظ أفضل الممارسات العالمية على صحة مزارع الخلايا ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى إذابة الخلايا الجديدة باستمرار ، وشراء وسائط زراعة الخلايا باهظة الثمن ، وتقليل كمية تطهير الحاضنة ووقت التوقف عن العمل.
Introduction
زراعة الخلايا لها العديد من الاستخدامات في مختبر الأبحاث. منذ نشأة زراعة الخلايا في أوائل القرن 20 ، ساعدت خطوط الخلايا في تقدم العلوم. خطوط الخلايا لها العديد من المزايا. يمكن أن تساعد خطوط الخلايا المختلفة الباحثين في دراسة بيولوجيا الخلية ، أو إنتاج فيروس البقعي لمزيد من الدراسات ، أو إنتاج كميات كبيرة من البروتين ذي الأهمية ، على سبيل المثال لا الحصر1. تشمل بعض الاستخدامات الإضافية دراسة نمو الأنسجة ، والمساعدة في تطوير اللقاح ، وأبحاث السموم ، ودراسة دور الجينات في الكائنات الحية السليمة والنماذج المريضة ، وإنتاج خطوط الخلايا الهجينة 2,3. يمكن لخطوط الخلايا أيضا تمكين إنتاج الدواء3. تقنيات التعقيم المناسبة ضرورية عند العمل مع خطوط الخلايا ؛ تنطبق الممارسات والتقنيات الموضحة في هذه المخطوطة على مختبرات الأبحاث حيث يتم تنفيذ أعمال زراعة الخلايا. لا تتم مناقشة إعدادات المختبر الأخرى.
غالبا ما يكون التلوث هو الشاغل الرئيسي عند القيام بعمل زراعة الخلايا. في سياق هذه الورقة ، يشير التلوث عموما إلى الفطريات والبكتيريا. الهدف العام من الطريقة الموضحة في هذه الورقة هو وصف شامل لأفضل الممارسات لتجنب التلوث. يجب على جميع أعضاء المختبر الالتزام بهذه الممارسات عند العمل في غرفة زراعة الخلايا في مختبر الأبحاث. يجب أن تضمن المختبرات أن جميع العمال مشاركون نشطون في استخدام أفضل الممارسات هذه لمنع التلوث. ستساعد معرفة الممارسات والتقنيات الصحيحة على ضمان بقاء مزارع الخلايا قابلة للحياة وصحية وخالية من التلوث. يعتمد تطوير هذه التقنية على البحث في الأدبيات ، وسبع سنوات من الخبرة في العمل مع مزارع الخلايا ، والحاجة إلى طريقة يمكن لكل من المبتدئين والعاملين ذوي الخبرة في زراعة الخلايا الرجوع إليها على أساس سنوي.
هناك حاجة إلى تقنية واضحة وموحدة يجب أن تتبعها جميع مختبرات زراعة الخلايا البحثية. تناقش الكثير من الأدبيات حول تلوث زراعة الخلايا الكشف عن الميكوبلازما ، وتقنيات التعقيم ، ومصادر التلوث ، والقضاء على الملوثات ، والوقاية باستخدام المضادات الحيوية والاختبار المنتظم4،5،6،7،8. في حين أن هذه المعلومات مفيدة ، لا توجد مقاطع فيديو موجودة في الأدبيات توضح تقنيات زراعة الخلايا المناسبة التي يجب على المرء اتباعها. تتمثل ميزة الممارسات المقدمة على التقنيات البديلة في التركيز على منع التلوث قبل حدوثه ، بدلا من اكتشاف الأخطاء وتصحيحها لاحقا. علاوة على ذلك ، فإن العرض الشامل لتقنيات التعقيم ، ومناقشة حول منع نمو الفطريات والبكتيريا ، والمعلومات المتعلقة بتدفق هواء خزانة السلامة الحيوية ذات قيمة لكل من العاملين المبتدئين وذوي الخبرة في زراعة الخلايا على حد سواء.
البكتيريا والفطريات هما النوعان الأكثر شيوعا من الملوثات. ضمن فئة البكتيريا ، تعد الميكوبلازما مصدر قلق كبير نظرا لصغر حجمها وقدرتها على التكاثر مع بقائها دون أن يلاحظها أحد. وهي كائنات حية ذاتية التكاثر ليس لها جدار خلوي صلب وتعتمد على الخلايا الحقيقية النواة لتنمو. لقد قللت من القدرات الأيضية ويمكن أن تتكاثر بشكل كبير بينما تظل غير معترف بها في الفحص البصري الروتيني لثقافات الخلايا والتحليل المجهري المنتظم ، على الرغم من أن المجهر الإلكتروني النافذ يمكنه اكتشاف الميكوبلازما 9,10. علاوة على ذلك ، يمكنهم المرور عبر المرشحات الميكروبيولوجية10. يوفر وسط زراعة الخلايا الميكوبلازما بالمواد المغذية ، على الرغم من أن تكملة الوسائط بالمضادات الحيوية للأسف لا تؤثر على الميكوبلازما10. ينبغي للمرء أن يلاحظ أنه ، بشكل عام ، ليس من الضروري استكمال الوسائط بالمضادات الحيوية. يجب أن تكون التقنيات المناسبة كافية في إبعاد التلوث. لا تؤدي الإصابة بالميكوبلازما إلى موت الخلايا الفوري ، ولكنها تثير قلق الباحثين لأنها تؤثر على قابلية استنساخ البيانات وجودتها.
يجب على جميع موظفي المختبر الالتزام الصارم بممارسات زراعة الخلايا الجيدة. يجب اختبار الثقافات بحثا عن الميكوبلازما بعد شرائها حديثا ، أثناء زراعتها حاليا ، وقبل حفظها بالتبريد ، وعند إذابتها من النيتروجين السائل 2,10. تتوفر اختبارات مختلفة في السوق باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) أو التلوين المناعي. 3 تشير الأدبيات إلى أن “العزلات البشرية تمثل نسبة كبيرة من ملوثات الميكوبلازما الموجودة في زراعة الخلايا”5. على الرغم من وصف أكثر من 200 نوع من الميكوبلازما ، إلا أن حوالي ستة منها تمثل معظم الإصابات. هذه الأنواع الستة هي M. arginini و M. fermentans و M. hominis و M. hyorhinis و M. orale و Acholeplasma laidlawii10. كما هو الحال مع أنواع التلوث الأخرى ، فإن الهواء والهباء الجوي يجلبانها إلى مزارع الخلايا5. يتردد صدى هذا في أوراق أخرى لأن “المشغل البشري يحتمل أن يكون أكبر خطر في المختبر”7. على الرغم من أن هذا يتم من خلال خطأ بشري ، إلا أنه يمكن القضاء على المخاطر إذا تم اتباع إجراء قياسي. لا يقتصر التساقط من الموظفين على تلوث الميكوبلازما فقط. عادة ما تصاب مزارع الخلايا في أحد المختبرات بنفس أنواع الميكوبلازما ، مما يشير إلى أن التلوث ينتشر من قارورة إلى أخرى بسبب تقنيات زراعة الخلايا غير الصحيحة10.
منع التلوث المتبادل هو أيضا سبب آخر لاتباع تقنيات زراعة الخلايا المناسبة. تجدر الإشارة إلى أن ما لا يقل عن 15٪ -18٪ من خطوط الخلايا في جميع أنحاء العالم قد تكون ملوثة أو تم تحديدها بشكل خاطئ11،12. بالإضافة إلى اختبار خطوط الخلايا للتلوث بالميكوبلازما ، يجب أيضا اختبارها للتلوث المتبادل10. بالنسبة لخطوط الخلايا البشرية ، فإن مصادقة خط الخلية بواسطة تقنية غير مكلفة قائمة على الحمض النووي تسمى التنميط القصير للتكرار الترادفي (STR) هي المعيار المرجعي الدولي الحالي ، لأنها طريقة سهلة لتأكيد هوية خط الخلية2،10،13،14. يمكن ل STR تحديد خطوط الخلايا ذات العلامات الخاطئة أو الملوثة ، ولكن لا يمكنها اكتشاف أصل الأنسجة غير الصحيح10،13،14. يمكن أن تتعرض صحة بيانات البحث للخطر إذا تم تسمية خطوط الخلايا بشكل خاطئ أو تم تحديدها بشكل خاطئ أو ملوثة13. على غرار الأنواع الأخرى من التلوث ، يمكن أن يحدث التلوث المتبادل بسبب سوء التقنية التي تتسبب في انتشار الهباء الجوي ، أو الاتصال الخاطئ الذي يؤدي إلى دخول نوع الخلية الخطأ إلى قارورة ، أو استخدام نفس زجاجة الوسائط والكواشف بخطوط خلايا مختلفة10. لا ينبغي أن يحدث أي مشاركة لزجاجات الوسائط ؛ يمكن أن تسمح مشاركة زجاجة واحدة من الوسائط بين خطين خلويين مختلفين بخلط مجموعات الخلايا هذه ، مما يؤدي إلى استيلاء نوع الخلية الأسرع نموا على القارورة تماما. هذا الاستبدال غير ملحوظ ويؤدي إلى خطأ في التسمية والتعريفالخاطئ 2. يمكن أيضا الخلط بين خط الخلية وخط آخر إذا تم الخلط بين الثقافات أثناء المناولة أو وضع العلاماتعلى 10. يجب إيلاء اهتمام دقيق للحفاظ على الكواشف والوسائط والقوارير منفصلة عن بعضها البعض. يجب أن يكون لكل عضو في المختبر زجاجات وسائط خاصة به ؛ يجب ألا تحدث مشاركة بين أعضاء المختبر. يجب شراء خطوط الخلايا نفسها من بنك خلوي مؤهل ومزود. يجب ألا تشارك المختبرات الخلايا. تشير الدراسات إلى أنه على الرغم من استخدام اختبارات STR والميكوبلازما بانتظام ، فقد استخدمت العديد من الأوراق البحثية في الأدبيات بالفعل خطوط خلايا خاطئة أو ملوثة15. إن غربلة البحث للعثور على هذه الأوراق الإشكالية وإبلاغ القراء بأثر رجعي بهذا الأمر أمر مرهق. الوقاية هي أفضل طريقة لضمان عدم حدوث هذه المشكلة في المقام الأول.
الإجراء البسيط لرش العناصر بنسبة 70٪ EtOH يمكن أن يقتل الكائنات الحية ؛ يعمل 70٪ EtOH عن طريق تغيير طبيعة البروتينات وإذابة الدهون في الكائنات الحية الأكثر تلويثا ، بما في ذلك البكتيريا والفطريات16. وقد أظهرت الدراسات أن 70 ٪ هو التركيز الأكثر فعالية. لا تتخثر البروتينات السطحية بسرعة مع 70٪ EtOH حتى تتمكن من دخول الخلية ، في حين أن الماء الذي يحتوي عليه ضروري لعملية تغيير طبيعة البروتينات. بسبب اختلاف تركيز الماء والكحول على جانبي جدار الخلية ، يدخل 70٪ EtOH الخلية لتشويه كل من البروتينات الأنزيمية والهيكلية. إذا لوحظ نمو العفن في قوارير ، فيجب تطهير الحاضنة بأكملها عن طريق رشها أولا بنسبة 70٪ EtOH ومسحها جافة ، تليها حضانة ليلية لمدة 16 ساعة عند 60 درجة مئوية17. هذا يقتل معظم العفن وأي بكتيريا.
الميزة الرئيسية لممارسات الوقاية على التقنيات البديلة للقضاء على التلوث بعد حدوثه هي أنه من خلال منع التلوث في وقت مبكر ، يمكن للعاملين في المختبرات التأكد من أن مزارع الخلايا الخاصة بهم صحية ولن تكون هناك تكاليف عالية مرتبطة بإزالة التلوث من الحاضنات أو التخلص من مزارع الخلايا. القضاء على ملوثات الميكوبلازما بعد ، على سبيل المثال ، ليس فعالا7. إن أخذ الوقت مبكرا لضمان تدريب موظفي المختبر بشكل صحيح ، وغرفة زراعة الخلايا قائمة بذاتها ، واستخدام إجراء قياسي سيوفر الوقت والمال.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن التلوث هو أحد الاهتمامات الرئيسية عند القيام بأعمال زراعة الخلايا ، فإن الممارسات والتقنيات الموضحة في هذه المخطوطة ستساعد في التخفيف من المخاطر. تشمل الخطوات الحاسمة ارتداء معطف مختبر نظيف ، والذي يستخدم فقط في غرفة زراعة الخلايا ، واستخدام قفازات نظيفة وخالية من البودرة يتم ر…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أصبح هذا العمل ممكنا بفضل التمويل من معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI). نود أن نشكر رئيسة مختبرنا ، جو تشين ، على قراءة المخطوطة وعلى دعمها المستمر ، ودونا تالنت على تعديلاتها وتعليقاتها المفيدة ، وجيف هينيفيلد من قسم تكنولوجيا المعلومات في جامعة روكفلر لمساعدته في مكون الفيديو في هذه المخطوطة.
Materials
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
References
- Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
- Stacey, G. N. Cell culture contamination. Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
- Barth, O. M., Majerowicz, S. Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer cell lines are useful model systems for medical research. Cancers. 11 (8), 1098 (2019).
- A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science Available from: https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you (2020)
- Langdon, S. P. Cell culture contamination: an overview. Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).
- Babic, Z., et al. Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines. eLife. 8, e41676 (2019).
- Visconti, P., et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).
- Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
- Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal Available from: https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference (2023)
- United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications Available from: https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf (2004)
- Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html (2023)
- Coté, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).
- Bykowski, T., Stevenson, B. Aseptic technique. Current Protocols in Microbiology. 56 (1), e98 (2020).
- How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire Available from: https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article (2020)
- Phelan, K., May, K. M. Mammalian cell tissue culture techniques. Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).
