Cellekulturteknikker og praksis for at undgå forurening med svampe og bakterier i forskningscellekulturlaboratoriet

Summary

Denne protokol præsenterer vigtige cellekulturteknikker og -praksis, der skal anvendes i forskningscellekulturlaboratoriet for at undgå forurening med svampe og bakterier. Inden for kategorien bakterier vil der blive lagt særlig vægt på at forhindre mycoplasma-kontaminering.

Abstract

Cellekultur er en delikat færdighed, der er nødvendig for dyrkning af menneske-, dyre- og insektceller eller andre væv i et kontrolleret miljø. Målet med protokollen er at understrege de korrekte teknikker, der anvendes i et forskningslaboratorium for at forhindre forurening fra svampe og bakterier. Der lægges særlig vægt på at undgå mycoplasmakontaminering, et stort problem i cellekulturrummet på grund af dets lille størrelse og resistens over for de fleste antibiotika, der anvendes til cellekultur. Disse samme teknikker sikrer kontinuerlig vækst og opretholder sunde celler. For både nye og erfarne cellekulturbrugere er det vigtigt konsekvent at overholde disse bedste fremgangsmåder for at mindske risikoen for kontaminering. En gang om året bør laboratorier gennemgå bedste praksis for cellekultur og følge op med en diskussion eller yderligere træning, hvis det er nødvendigt. Tidlig handling for at forhindre forurening i første omgang vil spare tid og penge sammenlignet med oprydning efter forurening. Universel bedste praksis holder cellekulturer sunde og reducerer derved behovet for konstant at tø nye celler op, købe dyre cellekulturmedier og reducere mængden af inkubatordekontaminering og nedetid.

Introduction

Cellekultur har mange anvendelser i forskningslaboratoriet. Siden cellekulturens oprindelse i begyndelsen af det 20. århundrede har cellelinjer hjulpet med at fremme videnskaben. Cellelinjer har flere fordele; Forskellige cellelinjer kan hjælpe forskere med at studere cellebiologi, producere baculovirus til yderligere undersøgelser eller producere store mængder af et protein af interesse, for at nævne nogle få¹. Nogle yderligere anvendelser omfatter undersøgelse af vævsvækst, hjælp til at fremme vaccineudvikling, toksikologiforskning, undersøgelse af genernes rolle i sunde organismer og syge modeller og produktion af hybridcellelinjer ^2,3. Cellelinjer kan også muliggøre lægemiddelproduktion³. Korrekte aseptiske teknikker er nødvendige, når man arbejder med cellelinjer; De fremgangsmåder og teknikker, der er skitseret i dette manuskript, gælder for forskningslaboratorier, hvor cellekulturarbejde udføres. Andre laboratorieindstillinger diskuteres ikke.

Forurening er ofte den primære bekymring, når man udfører cellekulturarbejde. I forbindelse med dette papir refererer forurening generelt til svampe og bakterier. Det overordnede mål med den metode, der er skitseret i dette papir, er grundigt at beskrive de bedste fremgangsmåder for at undgå forurening. Alle laboratoriemedlemmer skal overholde denne praksis, når de arbejder i et forskningslaboratoriums cellekulturrum. Laboratorierne bør sikre, at alle arbejdstagere deltager aktivt i anvendelsen af denne bedste praksis til forebyggelse af kontaminering. Kendskabet til den korrekte praksis og teknikker vil hjælpe med at sikre, at cellekulturer forbliver levedygtige, sunde og fri for forurening. Udviklingen af denne teknik er baseret på litteraturforskning, syv års erfaring med at arbejde med cellekulturer og behovet for en metode, som både nybegyndere og erfarne cellekulturarbejdere kan henvise til årligt.

Der er behov for en klar, standardiseret teknik, som alle forskningscellekulturlaboratorier bør følge. Meget af litteraturen om cellekulturkontaminering diskuterer påvisning af mycoplasma, aseptiske teknikker, forureningskilder, eliminering af forurenende stoffer og forebyggelse ved brug af antibiotika og regelmæssig test 4,5,6,7,8. Selvom disse oplysninger er nyttige, er der ingen videoer til stede i litteraturen, der demonstrerer de korrekte cellekulturteknikker, man skal følge. Fordelen ved den praksis, der præsenteres i forhold til alternative teknikker, er et fokus på at forhindre forurening, før den sker, snarere end at opdage og rette fejl senere. Desuden er en grundig demonstration af aseptiske teknikker, en diskussion om forebyggelse af svampe og bakterievækst og information om biosikkerhedskabinettets luftstrøm værdifulde for både nybegyndere og erfarne cellekulturarbejdere.

Bakterier og svampe er de to mest almindelige typer forurenende stoffer. Inden for bakteriekategorien er mycoplasma et stort problem på grund af dets lille størrelse og evne til at sprede sig, mens det forbliver ubemærket. De er selvreplikerende organismer uden stiv cellevæg, der er afhængige af eukaryote celler for at vokse. De har reducerede metaboliske evner og kan formere sig meget, mens de forbliver ukendte i den rutinemæssige visuelle inspektion af cellekulturer og regelmæssig mikroskopisk analyse, selvom transmissionselektronmikroskopi kan detektere mycoplasma ^9,10. Desuden kan de passere gennem mikrobiologiske filtre¹⁰. Cellekulturmedium giver mycoplasma næringsstoffer, selvom supplering af medier med antibiotika desværre ikke påvirker mycoplasma¹⁰. Man skal bemærke, at det generelt ikke er nødvendigt at supplere medier med antibiotika; Korrekte teknikker bør være tilstrækkelige til at holde forureningen i skak. Infektion med mycoplasma fører ikke til øjeblikkelig celledød, men det er bekymrende for forskere, da det påvirker datareproducerbarhed og kvalitet.

Alt laboratoriepersonale bør nøje overholde god cellekulturpraksis. Kulturer bør testes for mycoplasma, efter at de er blevet nykøbt, mens de dyrkes i øjeblikket, før kryopræservering, og når de optøes fra flydende nitrogen ^2,10. Forskellige tests er tilgængelige på markedet ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR), enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) eller immunfarvning. ³ Litteraturen indikerer, at “humane isolater udgør en stor procentdel af de mycoplasma-kontaminanter, der findes i cellekultur”⁵. Selvom mere end 200 mycoplasmaarter er blevet beskrevet, tegner omkring seks af disse sig for de fleste infektioner. Disse seks arter er M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale og Acholeplasma laidlawii¹⁰. Som med andre former for forurening bringer luft og aerosoler disse ind i cellekulturer⁵. Dette gentages i andre artikler, da “den menneskelige operatør potentielt er den største fare i laboratoriet”⁷. Selvom dette gøres gennem menneskelige fejl, kan risikoen elimineres, hvis en standardprocedure følges. Afgivelse fra personale er ikke begrænset til kun mycoplasmakontaminering; Cellekulturer i et laboratorium er normalt inficeret med de samme mycoplasmaarter, hvilket indikerer, at forurening spredes fra en kolbe til en anden på grund af ukorrekte cellekulturteknikker¹⁰.

Forebyggelse af krydskontaminering er også en anden grund til, at korrekte cellekulturteknikker skal følges. Det bemærkes, at mindst 15%-18% af cellelinjer på verdensplan kan være krydskontaminerede eller fejlidentificerede^11,12. Ud over at teste cellelinjer for mycoplasmakontaminering bør de også testes for krydskontaminering¹⁰. For humane cellelinjer er cellelinjegodkendelse ved hjælp af en billig DNA-baseret teknik kaldet kort tandemgentagelse (STR) profilering den nuværende internationale referencestandard, da det er en nem måde at bekræfte cellelinjeidentitet 2,10,13,14. STR kan identificere fejlmærkede eller krydskontaminerede cellelinjer, men det kan ikke detektere forkert vævsoprindelse^10,13,14. Gyldigheden af forskningsdata kan kompromitteres, hvis cellelinjer er forkert mærket, forkert identificeret eller forurenet¹³. I lighed med andre typer kontaminering kan krydskontaminering forekomme på grund af dårlig teknik, der får aerosoler til at sprede sig, forkert kontakt, der fører til, at den forkerte celletype kommer ind i en kolbe eller bruger den samme medieflaske og reagenser med forskellige cellelinjer¹⁰. Der bør ikke deles medieflasker; Deling af en flaske medier mellem to forskellige cellelinjer kan gøre det muligt at blande disse cellepopulationer, hvilket fører til, at den hurtigere voksende celletype helt overtager kolben. Denne udskiftning er ikke mærkbar og fører til fejlmærkning og fejlidentifikation². En cellelinje kan også forveksles med en anden, hvis kulturer er forvirrede under håndtering eller mærkning¹⁰. Der skal lægges stor vægt på at holde reagenser, medier og kolber adskilt fra hinanden. Hvert laboratoriemedlem skal have deres egne medieflasker; Der bør ikke ske deling mellem laboratoriemedlemmer. Cellelinjer selv bør købes fra en kvalificeret cellebank og udbyder. Laboratorier bør ikke dele celler. Undersøgelser viser, at selvom STR- og mycoplasma-test regelmæssigt anvendes, har mange forskningsartikler i litteraturen allerede brugt fejlidentificerede eller forurenede cellelinjer¹⁵. Sigtning gennem forskningen for at finde disse problematiske papirer og med tilbagevirkende kraft informere læserne om denne sag er besværlig. Forebyggelse er den bedste måde at sikre, at dette problem ikke opstår i første omgang.

Den enkle handling at sprøjte genstande med 70% EtOH kan dræbe organismer; 70% EtOH virker ved at denaturere proteiner og opløse lipider i de mest almindeligt forurenende organismer, herunder bakterier og svampe¹⁶. Undersøgelser har vist, at 70% er den mest effektive koncentration; overfladeproteiner koagulerer ikke hurtigt med 70% EtOH, så de kan komme ind i cellen, mens vandet, det indeholder, er nødvendigt for denatureringsprocessen af proteiner. På grund af koncentrationsforskellen mellem vand og alkohol på hver side af cellevæggen kommer 70% EtOH ind i cellen for at denaturere både enzymatiske og strukturelle proteiner. Hvis der observeres skimmelvækst i kolber, skal hele inkubatoren dekontamineres ved først at sprøjte den med 70% EtOH og tørre den tør efterfulgt af en 16 timers inkubation natten over ved 60 °C¹⁷. Dette dræber de fleste skimmel og eventuelle bakterier.

Den største fordel ved forebyggelsespraksis i forhold til alternative teknikker til eliminering af kontaminering, efter at den er opstået, er, at laboratoriearbejdere ved at forhindre kontaminering tidligt kan være sikre på, at deres cellekulturer er sunde, og at der ikke vil være høje omkostninger forbundet med dekontaminering af inkubatorer eller kassering af cellekulturer. Eliminering af mycoplasma-kontaminanter efter f.eks. er ikke effektiv⁷. At tage sig tid tidligt til at sikre, at laboratoriepersonalet er ordentligt uddannet, cellekulturrummet er selvstændigt, og der anvendes en standardprocedure, sparer tid og penge.

Protocol

1. Forberedelser GenerelBrug en ren laboratoriefrakke, der kun er beregnet til at blive båret i cellekulturrummet og ingen andre dele af laboratoriet.BEMÆRK: Labcoaten behøver ikke at være steril. Brug nye handsker, der ikke har rørt andre overflader. Sørg for, at handskerne sidder tæt. Nitril, pulverfri handsker er bedst.BEMÆRK: Handskerne behøver ikke at være sterile. For at forberede dig på arbejde skal du sprøjte handskerne, laboratoriefrak…

Representative Results

Hvis de korrekte cellekulturteknikker og -praksis, der er skitseret i dette papir, ikke følges, kan forurening med svampe og bakterier forekomme i forskningscellekulturlaboratoriet. Figur 2 viser kolber, der indeholder kontaminering i både suspensionskulturen og den vedhængende kultur. Når man ikke følger aseptiske teknikker, kan skimmelforurening forekomme 2-3 dage senere. Runde fuzzy bolde, der flyder i medierne, er mærkbare i suspensionsceller, mens skimm…

Discussion

Mens forurening er en af de primære bekymringer, når man udfører cellekulturarbejde, vil den praksis og de teknikker, der er skitseret i dette manuskript, hjælpe med at afbøde risiciene. De kritiske trin inkluderer at bære en ren laboratoriefrakke, som kun bruges i cellekulturrummet, ved hjælp af rene, pulverfrie handsker, der ofte sprøjtes med 70% EtOH, og som skiftes, når der skiftes mellem cellelinjer, opfordrer hver enkelt person til ikke at dele medieflasker, rengør kabinettet grundigt før og efter afslut…

Materials

DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques