טכניקות ושיטות תרבית תאים למניעת זיהום על ידי פטריות וחיידקים במעבדת המחקר לתרביות תאים
Summary
פרוטוקול זה מציג טכניקות ושיטות חיוניות לתרביות תאים שישמשו במעבדת המחקר לתרביות תאים כדי למנוע זיהום על ידי פטריות וחיידקים. בתוך קטגוריית החיידקים, יושם דגש מיוחד על מניעת זיהום מיקופלסמה.
Abstract
תרבית תאים היא מיומנות עדינה הנחוצה לגידול תאי אדם, בעלי חיים וחרקים, או רקמות אחרות, בסביבה מבוקרת. מטרת הפרוטוקול היא להדגיש את הטכניקות הנכונות המשמשות במעבדת מחקר למניעת זיהום מפטריות וחיידקים. דגש מיוחד מושם על הימנעות מזיהום מיקופלסמה, דאגה מרכזית בחדר תרביות התאים בשל גודלו הקטן ועמידותו לרוב האנטיביוטיקות המשמשות לתרביות תאים. אותן טכניקות מבטיחות צמיחה מתמשכת ושומרות על תאים בריאים. עבור משתמשים חדשים ומנוסים בתרביות תאים כאחד, חשוב לדבוק באופן עקבי בשיטות עבודה מומלצות אלה כדי להפחית את הסיכון לזיהום. פעם בשנה, מעבדות צריכות לבחון שיטות עבודה מומלצות לתרביות תאים ומעקב עם דיון או הכשרה נוספת במידת הצורך. נקיטת פעולה מוקדמת למניעת זיהום מלכתחילה תחסוך זמן וכסף, בהשוואה לניקוי לאחר התרחשות הזיהום. שיטות עבודה מומלצות אוניברסליות שומרות על תרביות תאים בריאות, ובכך מפחיתות את הצורך להפשיר תאים חדשים כל הזמן, לרכוש מדיה יקרה של תרביות תאים, ולהפחית את כמות הטיהור וההשבתה של האינקובטור.
Introduction
לתרבית תאים שימושים רבים במעבדת המחקר. מאז ראשית תרביות התאים בתחילת המאה ה-20, קווי תאים סייעו לקדם את המדע. לקווי תאים יש מספר יתרונות; קווי תאים שונים יכולים לסייע לחוקרים לחקור ביולוגיה של התא, לייצר baculovirus למחקרים נוספים, או לייצר כמויות גדולות של חלבון מעניין, אם לציין כמה1. שימושים נוספים כוללים חקר צמיחת רקמות, סיוע בקידום פיתוח חיסונים, מחקר טוקסיקולוגי, חקר תפקיד הגנים באורגניזמים בריאים ובמודלים חולים, וייצור קווי תאים היברידיים 2,3. קווי תאים יכולים גם לאפשר ייצור תרופות3. טכניקות אספטיות נכונות נחוצות בעת עבודה עם קווי תאים; הפרקטיקות והטכניקות המתוארות בכתב יד זה ישימות למעבדות מחקר שבהן מתבצעת עבודת תרבית תאים. הגדרות מעבדה אחרות אינן נדונות.
זיהום הוא לעתים קרובות הדאגה העיקרית בעת ביצוע עבודת תרבית תאים. בהקשר של מאמר זה, זיהום מתייחס בדרך כלל לפטריות וחיידקים. המטרה הכוללת של השיטה המתוארת במאמר זה היא לתאר ביסודיות את שיטות העבודה המומלצות למניעת זיהום. כל חברי המעבדה צריכים לדבוק בפרקטיקות אלה כאשר הם עובדים בחדר תרביות תאים של מעבדת מחקר. מעבדות צריכות להבטיח שכל העובדים הם משתתפים פעילים בשימוש בשיטות עבודה מומלצות אלה למניעת זיהום. הידע של שיטות העבודה והטכניקות הנכונות יסייע להבטיח שתרביות תאים יישארו בנות קיימא, בריאות וללא זיהום. פיתוח טכניקה זו מבוסס על מחקר הספרות, שבע שנות ניסיון בעבודה עם תרביות תאים, והצורך בשיטה שגם עובדים מתחילים וגם מנוסים בתרביות תאים יכולים להתייחס אליה על בסיס שנתי.
יש צורך בטכניקה ברורה וסטנדרטית שכל מעבדות המחקר לתרביות תאים צריכות לעקוב אחריה. רוב הספרות על זיהום תרביות תאים דנה בזיהוי מיקופלסמה, טכניקות אספטיות, מקורות זיהום, חיסול מזהמים ומניעה על ידי שימוש באנטיביוטיקה ובדיקות קבועות 4,5,6,7,8. בעוד שמידע זה מועיל, אין בספרות סרטונים המדגימים את טכניקות תרבית התאים הנכונות שיש לעקוב אחריהן. היתרון של הפרקטיקות המוצגות על פני טכניקות חלופיות הוא התמקדות במניעת זיהום לפני שהוא קורה, ולא באיתור ותיקון טעויות מאוחר יותר. יתר על כן, הדגמה יסודית של טכניקות אספטיות, דיון על מניעת צמיחת פטריות וחיידקים, ומידע לגבי זרימת האוויר בארון הבטיחות הביולוגית הם בעלי ערך עבור עובדי תרביות תאים מתחילים ומנוסים כאחד.
חיידקים ופטריות הם שני סוגי המזהמים הנפוצים ביותר. בתוך קטגוריית החיידקים, מיקופלסמה מהווה דאגה עיקרית בשל גודלה הקטן ויכולתה להתרבות מבלי שיבחינו בה. הם אורגניזמים המשכפלים את עצמם ללא דופן תא קשיחה, המסתמכים על תאים איקריוטים כדי לגדול. יש להם יכולות מטבוליות מופחתות והם יכולים להתרבות מאוד תוך שהם נשארים בלתי מזוהים בבדיקה חזותית שגרתית של תרביות תאים וניתוח מיקרוסקופי רגיל, אם כי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור יכול לזהות מיקופלסמה 9,10. יתר על כן, הם יכולים לעבור דרך מסננים מיקרוביולוגיים10. מדיום תרבית תאים מספק מיקופלסמה עם חומרים מזינים, אם כי למרבה הצער תוספת מדיה עם אנטיביוטיקה אינה משפיעה על מיקופלסמה10. יש לציין כי, באופן כללי, אין צורך להשלים את התקשורת עם אנטיביוטיקה; טכניקות נכונות צריכות להספיק כדי לשמור על זיהום במפרץ. זיהום במיקופלסמה אינו מוביל למוות תאי מיידי, אך הוא מדאיג את החוקרים מכיוון שהוא משפיע על שחזור הנתונים ואיכותם.
כל אנשי המעבדה צריכים להקפיד על שיטות תרבית תאים טובות. תרביות יש לבדוק מיקופלסמה לאחר שנרכשו לאחרונה, בזמן שהן גדלות כעת, לפני שימור בהקפאה, וכאשר הן מופשרות מחנקן נוזלי 2,10. בדיקות שונות זמינות בשוק באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA), או immunostaining. 3 הספרות מצביעה על כך ש”מבודדים אנושיים מייצגים אחוז גדול ממזהמי המיקופלסמה הנמצאים בתרביות תאים”5. למרות שתוארו יותר מ-200 מיני מיקופלסמה, כשישה מהם אחראים לרוב הזיהומים. ששת המינים הללו הם M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale ו-Acholeplasma laidlawii10. כמו עם סוגים אחרים של זיהום, אוויר ואירוסולים מביאים אותם לתוך תרביות תאים5. הדבר מהדהד במאמרים אחרים, שכן “המפעיל האנושי הוא בעל הפוטנציאל לסכנה הגדולה ביותר במעבדה”7. למרות שזה נעשה באמצעות טעות אנוש, הסיכון ניתן לבטל אם הליך סטנדרטי הוא אחריו. שפיכה מכוח אדם אינה מוגבלת רק לזיהום מיקופלסמה; תרביות תאים במעבדה אחת נגועות בדרך כלל באותו מין מיקופלסמה, דבר המצביע על כך שהזיהום מתפשט מבקבוק אחד למשנהו עקב טכניקות לא נכונות של תרביות תאים10.
מניעת זיהום צולב היא גם סיבה נוספת מדוע יש לעקוב אחר טכניקות תרבית תאים נכונות. יצוין כי לפחות 15%-18% מקווי התאים ברחבי העולם עשויים להיות מזוהמים צולבים או מזוהים באופן שגוי11,12. בנוסף לבדיקת קווי תאים לזיהום מיקופלסמה, יש לבדוק אותם גם לזיהום צולב10. עבור קווי תאים אנושיים, אימות קו התא באמצעות טכניקה זולה מבוססת DNA הנקראת פרופיל חזרה טנדם קצר (STR) הוא תקן הייחוס הבינלאומי הנוכחי, מכיוון שזו דרך קלה לאשר את זהות קו התא 2,10,13,14. STR יכול לזהות קווי תאים עם תווית שגויה או צולבת, אך הוא אינו יכול לזהות מקור רקמה שגוי10,13,14. תוקפם של נתוני מחקר עלול להיפגע אם קווי תאים מסומנים באופן שגוי, מזוהים באופן שגוי או מזוהמים13. בדומה לסוגים אחרים של זיהום, זיהום צולב יכול להתרחש עקב טכניקה לקויה הגורמת להתפשטות אירוסולים, מגע מוטעה המוביל לסוג תא שגוי להיכנס לצלוחית, או שימוש באותו בקבוק מדיה וריאגנטים עם קווי תאים שונים10. אין לשתף בקבוקי מדיה; שיתוף בקבוק אחד של מדיה בין שני קווי תאים שונים יכול לאפשר לאוכלוסיות תאים אלה להיות מעורבבות, מה שמוביל את סוג התא הגדל מהר יותר להשתלט לחלוטין על הצלוחית. החלפה זו אינה מורגשת ומובילה לתיוג שגוי ולזיהוי שגוי2. קו תא יכול גם להיות מוטעה אחר אם תרביות מתבלבלות במהלך טיפול או תיוג10. יש להקדיש תשומת לב רבה לשמירה על ריאגנטים, מדיה וצלוחיות בנפרד זה מזה. לכל חבר מעבדה צריכים להיות בקבוקי מדיה משלו; אין לשתף בין חברי המעבדה. את קווי הסלולר עצמם יש לרכוש מבנק סלולרי מוסמך וספק. מעבדות לא צריכות לחלוק תאים. מחקרים מראים כי למרות שבדיקות STR ומיקופלסמה נמצאות בשימוש קבוע, מחקרים רבים בספרות כבר השתמשו בקווי תאים מזוהים או מזוהמים15. סינון המחקר כדי למצוא את המאמרים הבעייתיים הללו וליידע את הקוראים בדיעבד בעניין זה הוא מסורבל. מניעה היא הדרך הטובה ביותר להבטיח בעיה זו לא מתרחשת מלכתחילה.
הפעולה הפשוטה של ריסוס פריטים עם 70% EtOH יכולה להרוג אורגניזמים; 70% EtOH פועל על ידי דנטורציה של חלבונים והמסת שומנים באורגניזמים המזהמים הנפוצים ביותר, כולל חיידקים ופטריות16. מחקרים הראו כי 70% הוא הריכוז היעיל ביותר; חלבונים פני השטח אינם נקרשים במהירות עם 70% EtOH כך שהם יכולים להיכנס לתא, בעוד המים שהוא מכיל נחוצים לתהליך דנטורציה של חלבונים. בשל הפרש הריכוזים של מים ואלכוהול משני צדי דופן התא, 70% EtOH נכנס לתא כדי לנטרל חלבונים אנזימטיים ומבניים. אם צמיחת עובש נצפתה בצלוחיות, יש לטהר את האינקובטור כולו על ידי ריסוס תחילה עם 70% EtOH וניגובו יבש, ולאחר מכן דגירה של 16 שעות לילה ב 60 ° C17. זה הורג את רוב העובש וכל חיידקים.
היתרון העיקרי של שיטות מניעה על פני טכניקות חלופיות של חיסול זיהום לאחר התרחשותו הוא שעל ידי מניעת זיהום בשלב מוקדם, עובדי מעבדה יכולים להיות בטוחים שתרביות התאים שלהם בריאות ולא יהיו עלויות גבוהות הקשורות לטיהור אינקובטורים או השלכת תרביות תאים. סילוק מזהמים מיקופלסמה לאחר, למשל, אינו יעיל7. אם ניקח את הזמן בשלב מוקדם כדי להבטיח שאנשי המעבדה מאומנים כראוי, חדר תרביות התאים יהיה עצמאי, ונעשה שימוש בהליך סטנדרטי יחסוך זמן וכסף.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד זיהום הוא אחד החששות העיקריים בעת ביצוע עבודת תרבית תאים, הפרקטיקות והטכניקות המתוארות בכתב יד זה יסייעו להפחית את הסיכונים. השלבים הקריטיים כוללים לבישת מעיל מעבדה נקי, המשמש רק בחדר תרביות התא, שימוש בכפפות נקיות ונטולות אבקה המרוססות ב-70% EtOH לעתים קרובות ומוחלפות בעת מעבר בין קווי …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו התאפשרה הודות למימון מהמכון הרפואי הווארד יוז (HHMI). ברצוננו להודות לראש המעבדה שלנו, ג’ו צ’ן, על קריאת כתב היד ועל תמיכתה המתמשכת, לדונה טאלנט על העריכות וההערות המועילות שלה, ולג’ף הנפלד מהמחלקה לטכנולוגיית מידע באוניברסיטת רוקפלר על עזרתו ברכיב הווידאו של כתב יד זה.
Materials
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
References
- Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
- Stacey, G. N. Cell culture contamination. Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
- Barth, O. M., Majerowicz, S. Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer cell lines are useful model systems for medical research. Cancers. 11 (8), 1098 (2019).
- A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science Available from: https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you (2020)
- Langdon, S. P. Cell culture contamination: an overview. Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).
- Babic, Z., et al. Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines. eLife. 8, e41676 (2019).
- Visconti, P., et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).
- Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
- Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal Available from: https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference (2023)
- United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications Available from: https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf (2004)
- Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html (2023)
- Coté, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).
- Bykowski, T., Stevenson, B. Aseptic technique. Current Protocols in Microbiology. 56 (1), e98 (2020).
- How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire Available from: https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article (2020)
- Phelan, K., May, K. M. Mammalian cell tissue culture techniques. Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).
