अनुसंधान सेल कल्चर प्रयोगशाला में कवक और बैक्टीरिया द्वारा संदूषण से बचने के लिए सेल कल्चर तकनीक और प्रथाएं
Summary
यह प्रोटोकॉल कवक और बैक्टीरिया द्वारा संदूषण से बचने के लिए अनुसंधान सेल संस्कृति प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली आवश्यक सेल कल्चर तकनीकों और प्रथाओं को प्रस्तुत करता है। बैक्टीरिया की श्रेणी के भीतर, माइकोप्लाज्मा संदूषण को रोकने पर विशेष जोर दिया जाएगा।
Abstract
सेल कल्चर एक नियंत्रित वातावरण में मानव, पशु और कीट कोशिकाओं, या अन्य ऊतकों को बढ़ाने के लिए आवश्यक एक नाजुक कौशल है। प्रोटोकॉल का लक्ष्य कवक और बैक्टीरिया से संदूषण को रोकने के लिए एक शोध प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली सही तकनीकों पर जोर देना है। माइकोप्लाज्मा संदूषण से बचने पर विशेष जोर दिया जाता है, जो सेल कल्चर रूम में एक बड़ी चिंता का विषय है क्योंकि इसके छोटे आकार और सेल कल्चर के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध के कारण। ये समान तकनीकें निरंतर विकास सुनिश्चित करती हैं और स्वस्थ कोशिकाओं को बनाए रखती हैं। नए और अनुभवी सेल संस्कृति उपयोगकर्ताओं के लिए समान रूप से, संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए इन सर्वोत्तम प्रथाओं का लगातार पालन करना महत्वपूर्ण है। वर्ष में एक बार, प्रयोगशालाओं को सेल संस्कृति सर्वोत्तम प्रथाओं की समीक्षा करनी चाहिए और यदि आवश्यक हो तो चर्चा या अतिरिक्त प्रशिक्षण के साथ अनुवर्ती कार्रवाई करनी चाहिए। पहले स्थान पर संदूषण को रोकने के लिए प्रारंभिक कार्रवाई करने से समय और धन की बचत होगी, संदूषण होने के बाद सफाई की तुलना में। सार्वभौमिक सर्वोत्तम प्रथाएं सेल संस्कृतियों को स्वस्थ रखती हैं, जिससे लगातार नई कोशिकाओं को पिघलाने, महंगे सेल कल्चर मीडिया खरीदने और इनक्यूबेटर परिशोधन और डाउनटाइम की मात्रा को कम करने की आवश्यकता कम हो जाती है।
Introduction
अनुसंधान प्रयोगशाला में सेल कल्चर के कई उपयोग हैं। 20 वीं शताब्दी की शुरुआत में सेल संस्कृति की उत्पत्ति के बाद से, सेल लाइनों ने विज्ञान को आगे बढ़ाने में मदद की है। सेल लाइनों के कई फायदे हैं; विभिन्न सेल लाइनें शोधकर्ताओं को सेल बायोलॉजी का अध्ययन करने, आगे के अध्ययन के लिए बैकुलोवायरस का उत्पादन करने,या बड़ी मात्रा में प्रोटीन का उत्पादन करने में मदद कर सकती हैं। कुछ अतिरिक्त उपयोगों में ऊतक वृद्धि का अध्ययन करना, वैक्सीन विकास को आगे बढ़ाने में मदद करना, विष विज्ञान अनुसंधान, स्वस्थ जीवों और रोगग्रस्त मॉडल में जीन की भूमिका का अध्ययन करना और हाइब्रिड सेल लाइनों 2,3 का उत्पादन शामिल है। सेल लाइनें दवा उत्पादन को भी सक्षम कर सकतीहैं 3. सेल लाइनों के साथ काम करते समय उचित सड़न रोकनेवाला तकनीक आवश्यक है; इस पांडुलिपि में उल्लिखित प्रथाएं और तकनीकें अनुसंधान प्रयोगशालाओं पर लागू होती हैं जहां सेल कल्चर कार्य किया जाता है। अन्य प्रयोगशाला सेटिंग्स पर चर्चा नहीं की जाती है।
सेल कल्चर कार्य करते समय संदूषण अक्सर प्राथमिक चिंता का विषय होता है। इस पेपर के संदर्भ में, संदूषण आम तौर पर कवक और बैक्टीरिया को संदर्भित करता है। इस पेपर में उल्लिखित विधि का समग्र लक्ष्य संदूषण से बचने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का पूरी तरह से वर्णन करना है। सभी प्रयोगशाला सदस्यों को एक शोध प्रयोगशाला के सेल कल्चर रूम में काम करते समय इन प्रथाओं का पालन करना चाहिए। प्रयोगशालाओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि सभी श्रमिक संदूषण को रोकने के लिए इन सर्वोत्तम प्रथाओं का उपयोग करने में सक्रिय भागीदार हैं। सही प्रथाओं और तकनीकों का ज्ञान यह सुनिश्चित करने में मदद करेगा कि सेल संस्कृतियां व्यवहार्य, स्वस्थ और संदूषण से मुक्त रहें। इस तकनीक का विकास साहित्य के अनुसंधान, सेल संस्कृतियों के साथ काम करने के सात साल के अनुभव और एक ऐसी विधि की आवश्यकता पर आधारित है जिसे नौसिखिए और अनुभवी सेल संस्कृति कार्यकर्ता दोनों वार्षिक आधार पर संदर्भित कर सकते हैं।
एक स्पष्ट, मानकीकृत तकनीक की आवश्यकता है जिसे सभी अनुसंधान सेल संस्कृति प्रयोगशालाओं का पालन करना चाहिए। सेल कल्चर संदूषण पर अधिकांश साहित्य माइकोप्लाज्मा का पता लगाने, सड़न रोकनेवाली तकनीकों, संदूषण के स्रोतों, दूषित पदार्थों के उन्मूलन और एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग और नियमित परीक्षण 4,5,6,7,8 की रोकथाम पर चर्चा करता है। हालांकि यह जानकारी सहायक है, साहित्य में कोई वीडियो मौजूद नहीं है जो उचित सेल संस्कृति तकनीकों का प्रदर्शन करता है जिसका पालन करना चाहिए। वैकल्पिक तकनीकों पर प्रस्तुत प्रथाओं का लाभ बाद में गलतियों का पता लगाने और सुधारने के बजाय, संदूषण को रोकने पर ध्यान केंद्रित करना है। इसके अलावा, सड़न रोकनेवाला तकनीकों का एक संपूर्ण प्रदर्शन, कवक और जीवाणु विकास को रोकने के बारे में चर्चा, और जैव सुरक्षा कैबिनेट एयरफ्लो के बारे में जानकारी नौसिखिया और अनुभवी सेल कल्चर श्रमिकों दोनों के लिए समान रूप से मूल्यवान है।
बैक्टीरिया और कवक दो सबसे आम प्रकार के दूषित पदार्थ हैं। बैक्टीरिया श्रेणी के भीतर, माइकोप्लाज्मा अपने छोटे आकार और प्रसार की क्षमता के कारण एक प्रमुख चिंता का विषय है, जबकि इस पर ध्यान नहीं दिया जाता है। वे आत्म-प्रतिकृति जीव हैं जिनमें कोई कठोर कोशिका भित्ति नहीं है जो बढ़ने के लिए यूकेरियोटिक कोशिकाओं पर निर्भर करते हैं। उन्होंने चयापचय क्षमताओं को कम कर दिया है और सेल संस्कृतियों के नियमित दृश्य निरीक्षण और नियमित सूक्ष्म विश्लेषण में अज्ञात रहते हुए बहुत बढ़ सकते हैं, हालांकि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी माइकोप्लाज्मा 9,10 का पता लगा सकती है। इसके अलावा, वे माइक्रोबायोलॉजिकल फिल्टर10 से गुजर सकते हैं। सेल कल्चर माध्यम पोषक तत्वों के साथ माइकोप्लाज्मा प्रदान करता है, हालांकि दुर्भाग्य से एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मीडिया को पूरक करना माइकोप्लाज्मा10 को प्रभावित नहीं करता है। किसी को ध्यान देना चाहिए कि, सामान्य तौर पर, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मीडिया को पूरक करना आवश्यक नहीं है; संदूषण को दूर रखने के लिए उचित तकनीक पर्याप्त होनी चाहिए। माइकोप्लाज्मा के साथ संक्रमण तत्काल कोशिका मृत्यु का कारण नहीं बनता है, लेकिन यह शोधकर्ताओं से संबंधित है क्योंकि यह डेटा प्रजनन क्षमता और गुणवत्ता को प्रभावित करता है।
सभी प्रयोगशाला कर्मियों को अच्छी सेल संस्कृति प्रथाओं का सख्ती से पालन करना चाहिए। संस्कृतियों को माइकोप्लाज्मा के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए जब वे नए खरीदे गए हैं, जबकि वे वर्तमान में उगाए जा रहे हैं, क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले, और जब तरल नाइट्रोजन 2,10 से पिघलाया जाता है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा), या इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करके बाजार पर विभिन्न परीक्षण उपलब्ध हैं। साहित्य इंगित करता है कि “मानव आइसोलेट्स सेल कल्चर में पाए जाने वाले माइकोप्लाज्मा दूषित पदार्थों के एक बड़े प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं”। हालांकि 200 से अधिक माइकोप्लाज्मा प्रजातियों का वर्णन किया गया है, इनमें से लगभग छह अधिकांश संक्रमणों के लिए जिम्मेदार हैं। ये छह प्रजातियां हैं एम. आर्गिनी, एम. फर्मेंटन्स, एम. होमिनिस, एम. ह्योरिनिस, एम. ओरल, और अचोलेप्लाज़्मा लेडलावी10. अन्य प्रकार के संदूषण के साथ, हवा और एरोसोल इन्हेंसेल संस्कृतियों में लाते हैं। यह अन्य पत्रों में प्रतिध्वनित होता है क्योंकि “मानव ऑपरेटर संभावित रूप से प्रयोगशाला में सबसे बड़ा खतरा है”। हालांकि यह मानव त्रुटि के माध्यम से किया जाता है, यदि एक मानक प्रक्रिया का पालन किया जाता है तो जोखिम को समाप्त किया जा सकता है। कर्मियों से शेडिंग केवल माइकोप्लाज्मा संदूषण तक ही सीमित नहीं है; एक प्रयोगशाला में सेल कल्चर आमतौर पर एक ही माइकोप्लाज्मा प्रजातियों से संक्रमित होते हैं, यह दर्शाता है कि अनुचित सेलकल्चर तकनीकों के कारण संदूषण एक फ्लास्क से दूसरे फ्लास्क में फैलता है।
क्रॉस-संदूषण की रोकथाम भी एक और कारण है कि उचित सेल कल्चर तकनीकों का पालन किया जाना चाहिए। यह ध्यान दिया जाता है कि दुनिया भर में कम से कम 15% -18% सेल लाइनें क्रॉस-दूषित यागलत पहचान की जा सकती हैं। माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए सेल लाइनों का परीक्षण करने के अलावा, उन्हें क्रॉस-संदूषण10 के लिए भी परीक्षण किया जाना चाहिए। मानव सेल लाइनों के लिए, शॉर्ट टेंडम रिपीट (एसटीआर) प्रोफाइलिंग नामक एक सस्ती डीएनए-आधारित तकनीक द्वारा सेल लाइन प्रमाणीकरण वर्तमान अंतरराष्ट्रीय संदर्भ मानक है, क्योंकि यह सेल लाइन पहचान 2,10,13,14 की पुष्टि करने का एक आसान तरीका है। एसटीआर गलत लेबल या क्रॉस-दूषित सेल लाइनों की पहचान कर सकता है, लेकिन यह गलत ऊतक उत्पत्ति10,13,14 का पता नहीं लगा सकता है। अनुसंधान डेटा की वैधता से समझौता किया जा सकता है यदि सेल लाइनों को गलत तरीके से लेबल किया जाता है, गलत तरीके से पहचाना जाता है, यादूषित किया जाता है। अन्य प्रकार के संदूषण के समान, क्रॉस-संदूषण खराब तकनीक के कारण हो सकता है जिससे एरोसोल फैल जाते हैं, गलत संपर्क के कारण गलत सेल प्रकार फ्लास्क में प्रवेश करता है, या विभिन्नसेल लाइनों के साथ एक ही मीडिया बोतल और अभिकर्मकों का उपयोग करता है। मीडिया की बोतलों का कोई साझाकरण नहीं होना चाहिए; दो अलग-अलग सेल लाइनों के बीच मीडिया की एक बोतल साझा करने से उन सेल आबादी को मिश्रित किया जा सकता है, जिससे तेजी से बढ़ते सेल प्रकार फ्लास्क पर पूरी तरह से कब्जा कर सकते हैं। यह प्रतिस्थापन ध्यान देने योग्य नहीं है और गलत लेबलिंग और गलत पहचान की ओर जाताहै। एक सेल लाइन को दूसरे के लिए भी गलत माना जा सकता है यदि संस्कृतियों को हैंडलिंग या लेबलिंग10 के दौरान भ्रमित किया जाता है। अभिकर्मकों, मीडिया और फ्लास्क को एक दूसरे से अलग रखने पर सावधानीपूर्वक ध्यान दिया जाना चाहिए। प्रत्येक प्रयोगशाला सदस्य के पास अपनी मीडिया बोतलें होनी चाहिए; प्रयोगशाला के सदस्यों के बीच कोई साझाकरण नहीं होना चाहिए। सेल लाइनों को स्वयं एक योग्य सेल बैंक और प्रदाता से खरीदा जाना चाहिए। प्रयोगशालाओं को कोशिकाओं को साझा नहीं करना चाहिए। अध्ययनों से पता चलता है कि, हालांकि एसटीआर और माइकोप्लाज्मा परीक्षण नियमित रूप से उपयोग किए जाते हैं, साहित्य में कई शोध पत्रों ने पहले से ही गलत पहचान या दूषित सेल लाइनों15 का उपयोग किया है। इन समस्याग्रस्त पत्रों को खोजने और इस मामले के बारे में पाठकों को पूर्वव्यापी रूप से सूचित करने के लिए शोध के माध्यम से जांच करना बोझिल है। रोकथाम यह सुनिश्चित करने का सबसे अच्छा तरीका है कि यह समस्या पहली जगह में नहीं होती है।
70% ईटीओएच के साथ वस्तुओं को छिड़कने की सरल क्रिया जीवों को मार सकती है; 70% ईटीओएच प्रोटीन को विकृत करके और बैक्टीरियाऔर कवक सहित सबसे अधिक दूषित जीवों में लिपिड को भंग करके काम करता है। अध्ययनों से पता चला है कि 70% सबसे प्रभावी एकाग्रता है; सतह प्रोटीन 70% ईटीओएच के साथ तेजी से जमा नहीं होते हैं ताकि वे कोशिका में प्रवेश कर सकें, जबकि इसमें मौजूद पानी प्रोटीन की विकृत प्रक्रिया के लिए आवश्यक है। सेल की दीवार के दोनों ओर पानी और अल्कोहल की एकाग्रता अंतर के कारण, 70% ईटीओएच एंजाइमेटिक और संरचनात्मक प्रोटीन दोनों को विकृत करने के लिए सेल में प्रवेश करता है। यदि फ्लास्क में मोल्ड वृद्धि देखी जाती है, तो पूरे इनक्यूबेटर को पहले 70% ईटीओएच के साथ छिड़काव करके और इसे सूखने से दूषित किया जाना चाहिए, इसके बाद 60 डिग्री सेल्सियस17 पर 16 घंटे रात भर इनक्यूबेशन किया जाना चाहिए। यह अधिकांश मोल्ड और किसी भी बैक्टीरिया को मारता है।
संदूषण को खत्म करने की वैकल्पिक तकनीकों पर रोकथाम प्रथाओं का मुख्य लाभ यह है कि संदूषण को जल्दी रोकने से, प्रयोगशाला कार्यकर्ता यह सुनिश्चित कर सकते हैं कि उनकी सेल संस्कृतियां स्वस्थ हैं और इनक्यूबेटरों के परिशोधन या सेल संस्कृतियों को त्यागने से जुड़ी कोई उच्च लागत नहीं होगी। उदाहरण के लिए, माइकोप्लाज्मा दूषित पदार्थों काउन्मूलन कुशल नहीं है। प्रयोगशाला कर्मियों को ठीक से प्रशिक्षित करने के लिए समय लेने के लिए, सेल कल्चर रूम स्व-निहित है, और एक मानक प्रक्रिया का उपयोग किया जाता है जो समय और धन बचाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि सेल कल्चर कार्य करते समय संदूषण प्राथमिक चिंताओं में से एक है, इस पांडुलिपि में उल्लिखित प्रथाओं और तकनीकों से जोखिमों को कम करने में मदद मिलेगी। महत्वपूर्ण चरणों में एक साफ लैब कोट पहनना शामिल ह?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (एचएचएमआई) से फंडिंग की बदौलत संभव हो पाया है। हम पांडुलिपि को पढ़ने और उनके निरंतर समर्थन के लिए प्रयोगशाला के प्रमुख, जू चेन को धन्यवाद देना चाहते हैं, डोना टालेंट को उनके सहायक संपादन और टिप्पणियों के लिए, और रॉकफेलर विश्वविद्यालय में सूचना प्रौद्योगिकी विभाग से जेफ हेनेफेल्ड को इस पांडुलिपि के वीडियो घटक के साथ उनकी मदद के लिए।
Materials
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
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