Cellodlingstekniker och -metoder för att undvika kontaminering av svampar och bakterier i forskningscellodlingslaboratoriet

Summary

Detta protokoll presenterar viktiga cellodlingstekniker och metoder som ska användas i forskningscellodlingslaboratoriet för att undvika kontaminering av svampar och bakterier. Inom kategorin bakterier kommer särskild vikt att läggas vid att förhindra mykoplasmakontaminering.

Abstract

Cellodling är en känslig färdighet som är nödvändig för odling av människor, djur och insektsceller eller andra vävnader i en kontrollerad miljö. Målet med protokollet är att betona de korrekta tekniker som används i ett forskningslaboratorium för att förhindra kontaminering från svampar och bakterier. Särskild vikt läggs vid att undvika mykoplasmakontaminering, ett stort problem i cellodlingsrummet på grund av dess lilla storlek och resistens mot de flesta antibiotika som används för cellodling. Samma tekniker säkerställer kontinuerlig tillväxt och upprätthåller friska celler. För både nya och erfarna cellodlingsanvändare är det viktigt att konsekvent följa dessa bästa metoder för att minska risken för kontaminering. En gång om året bör laboratorierna granska bästa praxis för cellodling och följa upp med en diskussion eller ytterligare utbildning vid behov. Att vidta tidiga åtgärder för att förhindra kontaminering i första hand kommer att spara tid och pengar, jämfört med att städa upp efter förorening. Universell bästa praxis håller cellkulturer friska, vilket minskar behovet av att ständigt tina nya celler, köpa dyra cellodlingsmedier och minska mängden inkubatordekontaminering och driftstopp.

Introduction

Cellodling har många användningsområden i forskningslaboratoriet. Sedan cellodlingens ursprung i början av 20-talet har cellinjer hjälpt till att främja vetenskapen. Cellinjer har flera fördelar; Olika cellinjer kan hjälpa forskare att studera cellbiologi, producera baculovirus för vidare studier eller producera stora mängder av ett protein av intresse, för att nämna några¹. Några ytterligare användningsområden inkluderar att studera vävnadstillväxt, hjälpa till att främja vaccinutveckling, toxikologisk forskning, studera genernas roll i friska organismer och sjuka modeller och produktion av hybridcellinjer ^2,3. Cellinjer kan också möjliggöra läkemedelsproduktion³. Korrekt aseptisk teknik är nödvändig när man arbetar med cellinjer; De metoder och tekniker som beskrivs i detta manuskript är tillämpliga på forskningslaboratorier där cellodlingsarbete utförs. Andra laboratoriemiljöer diskuteras inte.

Kontaminering är ofta det främsta problemet när man utför cellodlingsarbete. I samband med detta dokument hänvisar kontaminering i allmänhet till svampar och bakterier. Det övergripande målet med den metod som beskrivs i detta dokument är att noggrant beskriva de bästa metoderna för att undvika kontaminering. Alla laboratoriemedlemmar bör följa dessa metoder när de arbetar i ett forskningslaboratoriums cellodlingsrum. Laboratorierna bör se till att alla arbetstagare aktivt deltar i användningen av dessa bästa metoder för att förhindra kontaminering. Kunskapen om rätt praxis och tekniker hjälper till att säkerställa att cellkulturer förblir livskraftiga, friska och fria från kontaminering. Utvecklingen av denna teknik bygger på litteraturforskning, sju års erfarenhet av att arbeta med cellkulturer och behovet av en metod som både nybörjare och erfarna cellodlingsarbetare kan hänvisa till på årsbasis.

Det finns ett behov av en tydlig, standardiserad teknik som alla forskningscellodlingslaboratorier bör följa. Mycket av litteraturen om cellodlingskontaminering diskuterar detektion av mykoplasma, aseptiska tekniker, föroreningskällor, eliminering av föroreningar och förebyggande genom användning av antibiotika och regelbunden testning 4,5,6,7,8. Även om denna information är till hjälp, finns det inga videor i litteraturen som visar de korrekta cellodlingsteknikerna man bör följa. Fördelen med de metoder som presenteras jämfört med alternativa tekniker är fokus på att förhindra kontaminering innan det händer, snarare än att upptäcka och korrigera misstag senare. Dessutom är en grundlig demonstration av aseptiska tekniker, en diskussion om att förhindra svamp- och bakterietillväxt och information om luftflöde i biosäkerhetsskåp värdefulla för både nybörjare och erfarna cellodlingsarbetare.

Bakterier och svampar är de två vanligaste typerna av föroreningar. Inom bakteriekategorin är mykoplasma ett stort problem på grund av dess lilla storlek och förmåga att föröka sig medan den förblir obemärkt. De är självreplikerande organismer utan styv cellvägg som är beroende av eukaryota celler för att växa. De har nedsatt metabolisk förmåga och kan föröka sig kraftigt medan de förblir okända vid rutinmässig visuell inspektion av cellkulturer och regelbunden mikroskopisk analys, även om transmissionselektronmikroskopi kan detektera mykoplasma ^9,10. Dessutom kan de passera genom mikrobiologiska filter¹⁰. Cellodlingsmedium ger mykoplasma näringsämnen, även om tyvärr komplettering av media med antibiotika inte påverkar mykoplasma¹⁰. Man bör notera att det i allmänhet inte är nödvändigt att komplettera media med antibiotika; Lämpliga tekniker bör räcka för att hålla föroreningar i schack. Infektion med mykoplasma leder inte till omedelbar celldöd, men det är oroande för forskare eftersom det påverkar datareproducerbarhet och kvalitet.

All laboratoriepersonal bör strikt följa god cellodlingspraxis. Kulturer bör testas för mykoplasma efter att de nyligen har köpts, medan de för närvarande odlas, före kryokonservering och när de tinas från flytande kväve ^2,10. Olika tester finns tillgängliga på marknaden med polymeraskedjereaktion (PCR), enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) eller immunfärgning. ³ Litteraturen indikerar att “humana isolat representerar en stor andel av de mykoplasmaföroreningar som finns i cellodling”⁵. Även om mer än 200 mykoplasmaarter har beskrivits, står cirka sex av dessa för de flesta infektioner. Dessa sex arter är M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale och Acholeplasma laidlawii¹⁰. Som med andra typer av föroreningar tar luft och aerosoler dessa in i cellkulturer⁵. Detta upprepas i andra artiklar eftersom “den mänskliga operatören är potentiellt den största faran i laboratoriet”⁷. Även om detta görs genom mänskliga fel kan risken elimineras om ett standardförfarande följs. Utsöndring från personal är inte begränsad till endast mykoplasmakontaminering; Cellkulturer i ett laboratorium är vanligtvis infekterade med samma mykoplasmaarter, vilket indikerar att kontaminering sprider sig från en kolv till en annan på grund av felaktiga cellodlingstekniker¹⁰.

Förebyggandet av korskontaminering är också en annan anledning till att lämpliga cellodlingstekniker bör följas. Det noteras att minst 15%-18% av cellinjerna över hela världen kan vara korskontaminerade eller felidentifierade^11,12. Förutom att testa cellinjer för mykoplasmakontaminering bör de också testas för korskontaminering¹⁰. För mänskliga cellinjer är cellinjeautentisering med en billig DNA-baserad teknik som kallas kort tandemupprepning (STR) profilering den nuvarande internationella referensstandarden, eftersom det är ett enkelt sätt att bekräfta cellinjeidentitet 2,10,13,14. STR kan identifiera felmärkta eller korskontaminerade cellinjer, men det kan inte upptäcka felaktigt vävnadsursprung^10,13,14. Forskningsdatas giltighet kan äventyras om cellinjer är felmärkta, felaktigt identifierade eller förorenade¹³. I likhet med andra typer av kontaminering kan korskontaminering uppstå på grund av dålig teknik som orsakar aerosoler att spridas, felaktig kontakt som leder till att fel celltyp kommer in i en kolv eller använder samma mediaflaska och reagens med olika cellinjer¹⁰. Ingen delning av mediaflaskor bör ske; Att dela en flaska media mellan två olika cellinjer kan göra det möjligt att blanda dessa cellpopulationer, vilket leder till att den snabbare växande celltypen helt tar över kolven. Denna ersättning märks inte och leder till felmärkning och felidentifiering². En cellinje kan också misstas för en annan om kulturer förväxlas under hantering eller märkning¹⁰. Noggrann uppmärksamhet bör ägnas åt att hålla reagens, media och kolvar åtskilda från varandra. Varje labbmedlem bör ha sina egna mediaflaskor; Ingen delning bör ske mellan labbmedlemmar. Cellinjer själva bör köpas från en kvalificerad cellbank och leverantör. Laboratorier bör inte dela celler. Studier visar att, även om STR- och mykoplasmatester regelbundet används, har många forskningsartiklar i litteraturen redan använt felidentifierade eller förorenade cellinjer¹⁵. Att sikta igenom forskningen för att hitta dessa problematiska papper och retroaktivt informera läsarna om denna fråga är besvärligt. Förebyggande är det bästa sättet att säkerställa att detta problem inte uppstår i första hand.

Den enkla åtgärden att spruta föremål med 70% EtOH kan döda organismer; 70% EtOH fungerar genom att denaturera proteiner och lösa lipider i de vanligaste förorenande organismerna, inklusive bakterier och svampar¹⁶. Studier har visat att 70% är den mest effektiva koncentrationen; ytproteiner koagulerar inte snabbt med 70% EtOH så att de kan komma in i cellen, medan vattnet det innehåller är nödvändigt för denatureringsprocessen av proteiner. På grund av koncentrationsskillnaden mellan vatten och alkohol på vardera sidan av cellväggen kommer 70% EtOH in i cellen för att denaturera både enzymatiska och strukturella proteiner. Om mögeltillväxt observeras i kolvar, måste hela inkubatorn dekontamineras genom att först spruta den med 70% EtOH och torka den torr, följt av en 16 h inkubation över natten vid 60 °C¹⁷. Detta dödar de flesta mögel och eventuella bakterier.

Den största fördelen med förebyggande metoder jämfört med alternativa tekniker för att eliminera kontaminering efter det inträffar är att genom att förhindra kontaminering tidigt kan laboratoriearbetare vara säkra på att deras cellkulturer är friska och det kommer inte att finnas några höga kostnader i samband med dekontaminering av inkubatorer eller kassering av cellkulturer. Elimineringen av mykoplasmaföroreningar efter till exempel är inte effektiv⁷. Att ta sig tid tidigt för att säkerställa att laboratoriepersonalen är ordentligt utbildad, cellodlingsrummet är fristående och ett standardförfarande används sparar tid och pengar.

Protocol

1. Förberedelser AllmäntBär en ren labbrock avsedd att bäras endast i cellodlingsrummet och inga andra delar av laboratoriet.OBS: Labrocken behöver inte vara steril. Använd nya handskar som inte har rört några andra ytor. Se till att handskarna sitter tätt. Nitril, puderfria handskar är bäst.OBS: Handskarna behöver inte vara sterila. För att förbereda dig för arbete, spraya handskarna, labbrockärmarna och insidan av det biologiska säkerhet…

Representative Results

Om de korrekta cellodlingsteknikerna och metoderna som beskrivs i detta dokument inte följs kan kontaminering av svampar och bakterier uppstå i forskningscellodlingslaboratoriet. Figur 2 visar kolvar som innehåller kontaminering i både suspensions- och vidhäftningskulturerna. När man inte följer aseptiska tekniker kan mögelkontaminering inträffa 2-3 dagar senare. Runda fuzzy bollar som flyter i media är märkbara i suspensionsceller, medan mögeltillväx…

Discussion

Även om kontaminering är ett av de främsta problemen när man utför cellodlingsarbete, kommer de metoder och tekniker som beskrivs i detta manuskript att bidra till att mildra riskerna. De kritiska stegen inkluderar att bära en ren labbrock, som endast används i cellodlingsrummet, använda rena, pulverfria handskar som sprayas med 70% EtOH ofta och som byts när man växlar mellan cellinjer, uppmuntrar varje individ att inte dela mediaflaskor, rengör skåpet noggrant före och efter avslutat arbete, snyggt packa …

Materials

DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques