Araştırma Hücre Kültürü Laboratuvarında Mantar ve Bakterilerin Kontaminasyonunu Önlemek İçin Hücre Kültürü Teknikleri ve Uygulamaları
Summary
Bu protokol, mantar ve bakterilerin kontaminasyonunu önlemek için araştırma hücre kültürü laboratuvarında kullanılacak temel hücre kültürü tekniklerini ve uygulamalarını sunmaktadır. Bakteri kategorisinde, mikoplazma kontaminasyonunun önlenmesine özel önem verilecektir.
Abstract
Hücre kültürü, kontrollü bir ortamda insan, hayvan ve böcek hücrelerini veya diğer dokuları büyütmek için gerekli olan hassas bir beceridir. Protokolün amacı, mantar ve bakterilerden kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için bir araştırma laboratuvarında kullanılan doğru teknikleri vurgulamaktır. Küçük boyutu ve hücre kültürü için kullanılan çoğu antibiyotiğe direnci nedeniyle hücre kültürü odasında büyük bir endişe kaynağı olan mikoplazma kontaminasyonundan kaçınmaya özel önem verilmektedir. Aynı teknikler sürekli büyümeyi sağlar ve sağlıklı hücreleri korur. Hem yeni hem de deneyimli hücre kültürü kullanıcıları için, kontaminasyon riskini azaltmak için bu en iyi uygulamalara tutarlı bir şekilde uymak önemlidir. Yılda bir kez, laboratuvarlar hücre kültürü en iyi uygulamalarını gözden geçirmeli ve gerekirse bir tartışma veya ek eğitim ile takip etmelidir. İlk etapta kontaminasyonu önlemek için erken önlem almak, kontaminasyon meydana geldikten sonra temizlemeye kıyasla zamandan ve paradan tasarruf etmenizi sağlayacaktır. Evrensel en iyi uygulamalar hücre kültürlerini sağlıklı tutar, böylece sürekli olarak yeni hücreleri çözme, pahalı hücre kültürü ortamı satın alma ve inkübatör dekontaminasyon ve arıza süresini azaltma ihtiyacını azaltır.
Introduction
Hücre kültürünün araştırma laboratuvarında birçok kullanım alanı vardır. 20. yüzyılın başlarında hücre kültürünün kökenlerinden bu yana, hücre hatları bilimin ilerlemesine yardımcı olmuştur. Hücre hatlarının birçok avantajı vardır; Çeşitli hücre hatları, araştırmacıların hücre biyolojisini incelemelerine, daha ileri çalışmalar için bakülovirüs üretmelerine veya birkaç1’i adlandırmak için büyük miktarlarda ilgi çekici bir protein üretmelerine yardımcı olabilir. Bazı ek kullanımlar arasında doku büyümesinin incelenmesi, aşı geliştirmenin ilerlemesine yardımcı olunması, toksikoloji araştırması, sağlıklı organizmalarda ve hastalıklı modellerde genlerin rolünün incelenmesi ve hibrit hücre hatlarının üretimisayılabilir 2,3. Hücre hatları ayrıca ilaç üretimini de sağlayabilir3. Hücre hatları ile çalışırken uygun aseptik teknikler gereklidir; Bu makalede özetlenen uygulama ve teknikler, hücre kültürü çalışmalarının yapıldığı araştırma laboratuvarlarına uygulanabilir. Diğer laboratuvar ortamları tartışılmamıştır.
Kontaminasyon, hücre kültürü çalışması yaparken genellikle birincil endişe kaynağıdır. Bu makale bağlamında, kontaminasyon genellikle mantar ve bakterileri ifade eder. Bu makalede özetlenen yöntemin genel amacı, kontaminasyonu önlemek için en iyi uygulamaları kapsamlı bir şekilde tanımlamaktır. Tüm laboratuvar üyeleri, bir araştırma laboratuvarının hücre kültürü odasında çalışırken bu uygulamalara uymalıdır. Laboratuvarlar, tüm çalışanların kontaminasyonu önlemek için bu en iyi uygulamaları kullanmada aktif katılımcılar olmasını sağlamalıdır. Doğru uygulamaların ve tekniklerin bilgisi, hücre kültürlerinin canlı, sağlıklı ve kontaminasyondan uzak kalmasını sağlamaya yardımcı olacaktır. Bu tekniğin gelişimi, literatür araştırmalarına, hücre kültürleriyle çalışma deneyimine ve hem acemilerin hem de deneyimli hücre kültürü çalışanlarının yıllık bazda başvurabilecekleri bir yönteme duyulan ihtiyaca dayanmaktadır.
Tüm araştırma hücre kültürü laboratuvarlarının izlemesi gereken açık, standartlaştırılmış bir tekniğe ihtiyaç vardır. Hücre kültürü kontaminasyonu ile ilgili literatürün çoğunda, mikoplazmanın tespiti, aseptik teknikler, kontaminasyon kaynakları, kontaminantların ortadan kaldırılması ve antibiyotik kullanımı vedüzenli testler 4,5,6,7,8 ile önlenmesi tartışılmaktadır. Bu bilgiler yararlı olsa da, literatürde takip edilmesi gereken uygun hücre kültürü tekniklerini gösteren hiçbir video bulunmamaktadır. Sunulan uygulamaların alternatif tekniklere göre avantajı, hataları daha sonra tespit etmek ve düzeltmek yerine, kontaminasyonu gerçekleşmeden önce önlemeye odaklanmaktır. Ayrıca, aseptik tekniklerin kapsamlı bir gösterimi, mantarların ve bakteri üremesinin önlenmesi hakkında bir tartışma ve biyogüvenlik kabini hava akımı ile ilgili bilgiler hem acemi hem de deneyimli hücre kültürü çalışanları için değerlidir.
Bakteriler ve mantarlar en yaygın iki kirletici türüdür. Bakteri kategorisinde, mikoplazma, küçük boyutu ve fark edilmeden kalırken çoğalma kabiliyeti nedeniyle büyük bir endişe kaynağıdır. Büyümek için ökaryotik hücrelere dayanan sert hücre duvarı olmayan, kendi kendini kopyalayan organizmalardır. Metabolik yetenekleri azalmıştır ve hücre kültürlerinin rutin görsel muayenesinde ve düzenli mikroskobik analizde tanınmadan kalırken büyük ölçüde çoğalabilirler, ancak iletim elektron mikroskobu mikoplazma 9,10’u tespit edebilir. Ayrıca, mikrobiyolojik filtrelerden geçebilirler10. Hücre kültürü ortamı mikoplazmaya besin maddeleri sağlar, ancak ne yazık ki medyayı antibiyotiklerle desteklemek mikoplazma10’u etkilemez. Genel olarak, medyayı antibiyotiklerle desteklemenin gerekli olmadığı unutulmamalıdır; Kirlenmeyi uzak tutmak için uygun teknikler yeterli olmalıdır. Mikoplazma ile enfeksiyon anında hücre ölümüne yol açmaz, ancak veri tekrarlanabilirliğini ve kalitesini etkilediği için araştırmacıları ilgilendirir.
Tüm laboratuvar personeli iyi hücre kültürü uygulamalarına sıkı sıkıya bağlı kalmalıdır. Kültürler yeni satın alındıktan sonra, şu anda yetiştirilirken, kriyoprezervasyondan önce ve sıvı azot 2,10’dan çözüldüklerinde mikoplazma için test edilmelidir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) veya immünoboyama kullanılarak piyasada farklı testler mevcuttur. 3 Literatür, “insan izolatlarının, hücre kültüründe bulunan mikoplazma kirleticilerinin büyük bir yüzdesini temsil ettiğini”5 göstermektedir. 200’den fazla mikoplazma türü tanımlanmış olmasına rağmen, bunların yaklaşık altısı çoğu enfeksiyonu oluşturmaktadır. Bu altı tür M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale ve Acholeplasma laidlawii10’dur. Diğer kontaminasyon türlerinde olduğu gibi, hava ve aerosoller bunları hücre kültürlerine getirir5. Bu, “insan operatörü laboratuvardaki potansiyel olarak en büyük tehlikedir”7 nedeniyle diğer makalelerde de tekrarlanmaktadır. Bu insan hatası ile yapılsa da, standart bir prosedür izlenirse risk ortadan kaldırılabilir. Personelden dökülme sadece mikoplazma kontaminasyonu ile sınırlı değildir; Bir laboratuvardaki hücre kültürleri genellikle aynı mikoplazma türleriyle enfekte olur, bu da kontaminasyonun yanlış hücre kültürü teknikleri nedeniyle bir şişeden diğerine yayıldığını gösterir10.
Çapraz kontaminasyonun önlenmesi de uygun hücre kültürü tekniklerinin izlenmesinin bir başka nedenidir. Dünya çapında hücre hatlarının en az% 15-18’inin çapraz kontamine olabileceği veya yanlış tanımlanabileceği belirtilmektedir11,12. Hücre hatlarını mikoplazma kontaminasyonu açısından test etmenin yanı sıra, çapraz kontaminasyon10 için de test edilmelidirler. İnsan hücre hatları için, kısa tandem tekrarlama (STR) profillemesi adı verilen ucuz bir DNA tabanlı teknikle hücre hattı kimlik doğrulaması, hücre hattı kimliğini 2,10,13,14 doğrulamanın kolay bir yolu olduğu için mevcut uluslararası referans standardıdır. STR, yanlış etiketlenmiş veya çapraz kontamine olmuş hücre hatlarını tanımlayabilir, ancak yanlış doku orijinini tespit edemez10,13,14. Araştırma verilerinin geçerliliği, hücre hatlarının yanlış etiketlenmesi, yanlış tanımlanması veya kirlenmesi durumunda tehlikeye girebilir13. Diğer kontaminasyon türlerine benzer şekilde, aerosollerin yayılmasına neden olan zayıf teknik, bir şişeye giren yanlış hücre tipine yol açan yanlış temas veya farklı hücre hatlarına sahip aynı ortam şişesini ve reaktiflerini kullanan aynı ortam şişesi ve reaktifleri kullanarak çapraz kontaminasyon oluşabilir10. Medya şişelerinin paylaşılmaması gerekir; Bir şişe ortamın iki farklı hücre çizgisi arasında paylaşılması, bu hücre popülasyonlarının karıştırılmasına izin verebilir ve daha hızlı büyüyen hücre tipinin şişeyi tamamen ele geçirmesine neden olabilir. Bu değiştirme fark edilmez ve yanlış etiketlemeye ve yanlış tanımlamaya yol açar2. Bir hücre çizgisi,10’un işlenmesi veya etiketlenmesi sırasında kültürlerin karıştırılması durumunda başka bir hücre çizgisiyle de karıştırılabilir. Reaktifleri, medyayı ve şişeleri birbirinden ayrı tutmaya dikkat edilmelidir. Her laboratuvar üyesinin kendi medya şişeleri olmalıdır; Laboratuvar üyeleri arasında hiçbir paylaşım gerçekleşmemelidir. Hücre hatlarının kendileri nitelikli bir hücre bankasından ve sağlayıcıdan satın alınmalıdır. Laboratuvarlar hücreleri paylaşmamalıdır. Çalışmalar, STR ve mikoplazma testlerinin düzenli olarak kullanılmasına rağmen, literatürdeki birçok araştırma makalesinin yanlış tanımlanmış veya kontamine olmuş hücre hatlarını zaten kullandığını göstermektedir15. Bu sorunlu makaleleri bulmak ve okuyucuları bu konuda geriye dönük olarak bilgilendirmek için araştırmayı gözden geçirmek hantaldır. Önleme, bu sorunun ilk etapta ortaya çıkmamasını sağlamanın en iyi yoludur.
Öğelerin% 70 EtOH ile püskürtülmesinin basit eylemi organizmaları öldürebilir; % 70 EtOH, proteinleri denatüre ederek ve bakteri ve mantarlar da dahil olmak üzere en yaygın kirletici organizmalarda lipitleri çözerek çalışır16. Çalışmalar,% 70’in en etkili konsantrasyon olduğunu göstermiştir; Yüzey proteinleri% 70 EtOH ile hızlı bir şekilde pıhtılaşmaz, böylece hücreye girebilirler, içerdiği su ise proteinlerin denatüre etme işlemi için gereklidir. Hücre duvarının her iki tarafındaki su ve alkolün konsantrasyon farkı nedeniyle,% 70 EtOH hem enzimatik hem de yapısal proteinleri denatüre etmek için hücreye girer. Şişelerde küf büyümesi gözlenirse, tüm inkübatör önce% 70 EtOH ile püskürtülerek ve kuru olarak silinerek dekontamine edilmeli, ardından 60 ° C’de16 saat boyunca inkübasyon yapılmalıdır. Bu çoğu küfü ve bakteriyi öldürür.
Önleme uygulamalarının, kontaminasyon oluştuktan sonra ortadan kaldırmaya yönelik alternatif tekniklere göre temel avantajı, laboratuvar çalışanlarının kontaminasyonu erken önleyerek, hücre kültürlerinin sağlıklı olduğundan ve inkübatörlerin dekontaminasyonu veya hücre kültürlerinin atılması ile ilişkili yüksek maliyetler olmayacağından emin olabilmeleridir. Örneğin, mikoplazma kontaminantlarının daha sonra elimine edilmesi etkili değildir7. Laboratuvar personelinin uygun şekilde eğitildiğinden, hücre kültürü odasının kendi kendine yeten bir yer olduğundan ve standart bir prosedürün kullanıldığından emin olmak için erkenden zaman ayırmak, zamandan ve paradan tasarruf etmenizi sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kontaminasyon, hücre kültürü çalışması yaparken birincil endişelerden biri olsa da, bu makalede özetlenen uygulamalar ve teknikler risklerin azaltılmasına yardımcı olacaktır. Kritik adımlar arasında, sadece hücre kültürü odasında kullanılan temiz bir laboratuvar önlüğü giymek, sık sık% 70 EtOH ile püskürtülen ve hücre hatları arasında geçiş yaparken değiştirilen temiz, pudrasız eldivenler kullanmak, her bireyi medya şişelerini paylaşmamaya teşvik etmek, kabini işten önce ve s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Howard Hughes Tıp Enstitüsü’nün (HHMI) finansmanı sayesinde mümkün olmuştur. Laboratuvar başkanımız Jue Chen’e makaleyi okuduğu ve sürekli desteği için, Donna Tallent’e yararlı düzenlemeleri ve yorumları için ve Rockefeller Üniversitesi Bilgi Teknolojisi Bölümü’nden Jeff Hennefeld’e bu makalenin video bileşenindeki yardımları için teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
References
- Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
- Stacey, G. N. Cell culture contamination. Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
- Barth, O. M., Majerowicz, S. Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer cell lines are useful model systems for medical research. Cancers. 11 (8), 1098 (2019).
- A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science Available from: https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you (2020)
- Langdon, S. P. Cell culture contamination: an overview. Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).
- Babic, Z., et al. Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines. eLife. 8, e41676 (2019).
- Visconti, P., et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).
- Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
- Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal Available from: https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference (2023)
- United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications Available from: https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf (2004)
- Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html (2023)
- Coté, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).
- Bykowski, T., Stevenson, B. Aseptic technique. Current Protocols in Microbiology. 56 (1), e98 (2020).
- How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire Available from: https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article (2020)
- Phelan, K., May, K. M. Mammalian cell tissue culture techniques. Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).
