Tecniche e pratiche di coltura cellulare per evitare la contaminazione da funghi e batteri nel laboratorio di coltura cellulare di ricerca

Summary

Questo protocollo presenta le tecniche e le pratiche essenziali di coltura cellulare da utilizzare nel laboratorio di coltura cellulare di ricerca per evitare la contaminazione da funghi e batteri. All’interno della categoria dei batteri, particolare enfasi sarà posta sulla prevenzione della contaminazione da micoplasma.

Abstract

La coltura cellulare è un’abilità delicata necessaria per la crescita di cellule umane, animali e di insetti, o altri tessuti, in un ambiente controllato. L’obiettivo del protocollo è quello di sottolineare le corrette tecniche utilizzate in un laboratorio di ricerca per prevenire la contaminazione da funghi e batteri. Particolare enfasi è posta sull’evitare la contaminazione da micoplasma, una delle principali preoccupazioni nella sala di coltura cellulare a causa delle sue piccole dimensioni e della resistenza alla maggior parte degli antibiotici utilizzati per la coltura cellulare. Queste stesse tecniche assicurano una crescita continua e mantengono le cellule sane. Sia per gli utenti nuovi che per quelli esperti, è importante aderire costantemente a queste migliori pratiche per mitigare il rischio di contaminazione. Una volta all’anno, i laboratori dovrebbero rivedere le migliori pratiche di coltura cellulare e seguire con una discussione o una formazione aggiuntiva, se necessario. Agire tempestivamente per prevenire la contaminazione in primo luogo farà risparmiare tempo e denaro, rispetto alla pulizia dopo che si è verificata la contaminazione. Le migliori pratiche universali mantengono sane le colture cellulari, riducendo così la necessità di scongelare costantemente nuove cellule, acquistare costosi terreni di coltura cellulare e ridurre la quantità di decontaminazione e tempi di fermo dell’incubatore.

Introduction

La coltura cellulare ha molti usi nel laboratorio di ricerca. Fin dalle origini della coltura cellulare all’inizio del 20 ° secolo, le linee cellulari hanno contribuito a far progredire la scienza. Le linee cellulari hanno diversi vantaggi; Varie linee cellulari possono aiutare i ricercatori a studiare la biologia cellulare, produrre baculovirus per ulteriori studi o produrre grandi quantità di una proteina di interesse, per citarne alcune¹. Alcuni usi aggiuntivi includono lo studio della crescita dei tessuti, contribuendo a far progredire lo sviluppo di vaccini, la ricerca tossicologica, lo studio del ruolo dei geni negli organismi sani e nei modelli malati e la produzione di linee cellulari ibride ^2,3. Le linee cellulari possono anche consentire la produzione di farmaci³. Sono necessarie tecniche asettiche adeguate quando si lavora con linee cellulari; Le pratiche e le tecniche descritte in questo manoscritto sono applicabili ai laboratori di ricerca in cui viene eseguito il lavoro di coltura cellulare. Altre impostazioni di laboratorio non sono discusse.

La contaminazione è spesso la preoccupazione principale quando si esegue il lavoro di coltura cellulare. Nel contesto di questo documento, la contaminazione si riferisce generalmente a funghi e batteri. L’obiettivo generale del metodo delineato in questo documento è quello di descrivere in modo approfondito le migliori pratiche per evitare la contaminazione. Tutti i membri del laboratorio dovrebbero aderire a queste pratiche quando lavorano nella sala di coltura cellulare di un laboratorio di ricerca. I laboratori dovrebbero garantire che tutti i lavoratori partecipino attivamente all’utilizzo di queste migliori pratiche per prevenire la contaminazione. La conoscenza delle pratiche e delle tecniche corrette contribuirà a garantire che le colture cellulari rimangano vitali, sane e prive di contaminazioni. Lo sviluppo di questa tecnica si basa sulla ricerca della letteratura, sette anni di esperienza di lavoro con colture cellulari e la necessità di un metodo a cui sia i principianti che gli esperti di colture cellulari possano fare riferimento su base annuale.

C’è bisogno di una tecnica chiara e standardizzata che tutti i laboratori di colture cellulari di ricerca dovrebbero seguire. Gran parte della letteratura sulla contaminazione da colture cellulari discute la rilevazione di micoplasma, tecniche asettiche, fonti di contaminazione, eliminazione di contaminanti e prevenzione mediante l’uso di antibiotici e test regolari 4,5,6,7,8. Mentre queste informazioni sono utili, non ci sono video presenti in letteratura che dimostrano le corrette tecniche di coltura cellulare da seguire. Il vantaggio delle pratiche presentate rispetto alle tecniche alternative è l’attenzione alla prevenzione della contaminazione prima che accada, piuttosto che rilevare e correggere gli errori in seguito. Inoltre, una dimostrazione approfondita delle tecniche asettiche, una discussione sulla prevenzione della crescita di funghi e batteri e informazioni sul flusso d’aria dell’armadio di biosicurezza sono preziose sia per i principianti che per gli esperti di colture cellulari.

Batteri e funghi sono i due tipi più comuni di contaminanti. All’interno della categoria dei batteri, il micoplasma è una delle principali preoccupazioni a causa delle sue piccole dimensioni e della capacità di proliferare rimanendo inosservato. Sono organismi autoreplicanti senza parete cellulare rigida che si basano su cellule eucariotiche per crescere. Hanno ridotte capacità metaboliche e possono moltiplicarsi notevolmente pur rimanendo non riconosciuti nell’ispezione visiva di routine delle colture cellulari e nelle regolari analisi microscopiche, sebbene la microscopia elettronica a trasmissione possa rilevare il micoplasma ^9,10. Inoltre, possono passare attraverso filtri microbiologici¹⁰. Il terreno di coltura cellulare fornisce al micoplasma sostanze nutritive, anche se sfortunatamente l’integrazione dei terreni con antibiotici non influisce sul micoplasma¹⁰. Si dovrebbe notare che, in generale, non è necessario integrare i media con antibiotici; Le tecniche adeguate dovrebbero essere sufficienti per tenere a bada la contaminazione. L’infezione da micoplasma non porta alla morte cellulare immediata, ma è preoccupante per i ricercatori in quanto influisce sulla riproducibilità e sulla qualità dei dati.

Tutto il personale di laboratorio deve attenersi rigorosamente alle buone pratiche di coltura cellulare. Le colture dovrebbero essere testate per il micoplasma dopo che sono state appena acquistate, mentre sono attualmente in fase di coltivazione, prima della crioconservazione e quando sono scongelate dall’azoto liquido ^2,10. Sul mercato sono disponibili diversi test che utilizzano la reazione a catena della polimerasi (PCR), il saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA) o l’immunocolorazione. ³ La letteratura indica che “gli isolati umani rappresentano una grande percentuale dei contaminanti del micoplasma presenti nelle colture cellulari”⁵. Sebbene siano state descritte più di 200 specie di micoplasmi, circa sei di queste rappresentano la maggior parte delle infezioni. Queste sei specie sono M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale e Acholeplasma laidlawii¹⁰. Come per altri tipi di contaminazione, l’aria e gli aerosol li portano in colture cellulari⁵. Questo è riecheggiato in altri articoli poiché “l’operatore umano è potenzialmente il più grande pericolo in laboratorio”⁷. Sebbene ciò avvenga attraverso l’errore umano, il rischio può essere eliminato se viene seguita una procedura standard. Lo spargimento da parte del personale non è limitato alla sola contaminazione da micoplasma; Le colture cellulari in un laboratorio sono generalmente infettate dalla stessa specie di micoplasma, il che indica che la contaminazione si diffonde da un matraccio all’altro a causa di tecniche di coltura cellulare improprie¹⁰.

La prevenzione della contaminazione incrociata è anche un altro motivo per cui dovrebbero essere seguite adeguate tecniche di coltura cellulare. Si noti che almeno il 15%-18% delle linee cellulari in tutto il mondo può essere contaminato o erroneamente identificato^11,12. Oltre a testare le linee cellulari per la contaminazione da micoplasma, dovrebbero anche essere testate per la contaminazione incrociata¹⁰. Per le linee cellulari umane, l’autenticazione della linea cellulare mediante una tecnica economica basata sul DNA chiamata short tandem repeat (STR) è l’attuale standard internazionale di riferimento, in quanto è un modo semplice per confermare l’identità della linea cellulare 2,10,13,14. STR può identificare linee cellulari erroneamente etichettate o contaminate incrociate, ma non può rilevare l’origine errata del tessuto^10,13,14. La validità dei dati di ricerca può essere compromessa se le linee cellulari sono etichettate in modo errato, identificate erroneamente o contaminate¹³. Analogamente ad altri tipi di contaminazione, la contaminazione incrociata può verificarsi a causa di una tecnica scadente che causa la diffusione di aerosol, un contatto errato che porta al tipo di cellula sbagliato che entra in un pallone o utilizza lo stesso flacone di supporto e reagenti con linee cellulari diverse¹⁰. Non dovrebbe verificarsi alcuna condivisione di bottiglie multimediali; La condivisione di una bottiglia di terreno tra due diverse linee cellulari può consentire a quelle popolazioni cellulari di essere mescolate, portando il tipo di cellula a crescita più rapida a prendere completamente il controllo del pallone. Questa sostituzione non è evidente e porta a errori di etichettatura e identificazione errata². Una linea cellulare può anche essere scambiata per un’altra se le colture vengono confuse durante la manipolazione o l’etichettatura¹⁰. Si dovrebbe prestare particolare attenzione a mantenere i reagenti, i mezzi e i palloni separati l’uno dall’altro. Ogni membro del laboratorio dovrebbe avere le proprie bottiglie di supporto; Non deve verificarsi alcuna condivisione tra i membri del lab. Le linee cellulari stesse dovrebbero essere acquistate da una banca cellulare qualificata e da un fornitore. I laboratori non dovrebbero condividere le cellule. Gli studi dimostrano che, sebbene i test STR e micoplasma siano regolarmente utilizzati, molti articoli di ricerca in letteratura hanno già utilizzato linee cellulari identificate erroneamente o contaminate¹⁵. Spulciare la ricerca per trovare questi documenti problematici e informare retroattivamente i lettori su questo argomento è ingombrante. La prevenzione è il modo migliore per garantire che questo problema non si verifichi in primo luogo.

La semplice azione di spruzzare articoli con il 70% di EtOH può uccidere gli organismi; Il 70% di EtOH agisce denaturando le proteine e sciogliendo i lipidi negli organismi più comunemente contaminanti, inclusi batteri e funghi¹⁶. Gli studi hanno dimostrato che il 70% è la concentrazione più efficace; le proteine di superficie non coagulano rapidamente con il 70% di EtOH quindi possono entrare nella cellula, mentre l’acqua che contiene è necessaria per il processo di denaturazione delle proteine. A causa della differenza di concentrazione di acqua e alcol su entrambi i lati della parete cellulare, il 70% di EtOH entra nella cellula per denaturare sia le proteine enzimatiche che strutturali. Se si osserva la crescita di muffe in palloni, l’intera incubatrice deve essere decontaminata spruzzandola prima con il 70% di EtOH e asciugandola, seguita da un’incubazione notturna di 16 ore a 60 °C¹⁷. Questo uccide la maggior parte delle muffe e di tutti i batteri.

Il principale vantaggio delle pratiche di prevenzione rispetto alle tecniche alternative di eliminazione della contaminazione dopo che si è verificata è che prevenendo la contaminazione nella fase iniziale, gli operatori di laboratorio possono essere sicuri che le loro colture cellulari siano sane e non ci saranno costi elevati associati alla decontaminazione degli incubatori o allo scarto delle colture cellulari. L’eliminazione dei contaminanti del micoplasma dopo, ad esempio, non è efficiente⁷. Prendersi il tempo in anticipo per garantire che il personale di laboratorio sia adeguatamente addestrato, la sala di coltura cellulare sia autonoma e venga utilizzata una procedura standard consentirà di risparmiare tempo e denaro.

Protocol

1. Preparativi GeneraleIndossare un camice pulito designato per essere indossato solo nella sala di coltura cellulare e in nessun’altra parte del laboratorio.NOTA: il camice da laboratorio non deve essere sterile. Indossare guanti nuovi che non abbiano toccato altre superfici. Assicurati che i guanti aderiscano perfettamente. I guanti in nitrile e senza polvere sono i migliori.NOTA: I guanti non devono essere sterili. Per prepararsi al lavoro, spruzzare i …

Representative Results

Se non vengono seguite le tecniche e le pratiche di coltura cellulare descritte in questo documento, la contaminazione da funghi e batteri può verificarsi nel laboratorio di coltura cellulare di ricerca. La figura 2 mostra i palloni contenenti contaminazione sia nelle colture in sospensione che in quelle aderenti. Quando non si seguono tecniche asettiche, la contaminazione della muffa può verificarsi 2-3 giorni dopo. Le sfere rotonde sfocate che galleggiano nei …

Discussion

Mentre la contaminazione è una delle preoccupazioni principali quando si esegue il lavoro di coltura cellulare, le pratiche e le tecniche descritte in questo manoscritto aiuteranno a mitigare i rischi. I passaggi critici includono indossare un camice da laboratorio pulito, che viene utilizzato solo nella sala di coltura cellulare, utilizzare guanti puliti e privi di polvere che vengono spruzzati spesso con il 70% di EtOH e che vengono cambiati quando si passa da una linea cellulare all’altra, incoraggiare ogni individuo…

Materials

DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques