Toepassing van het intelligente high-throughput antimicrobiële gevoeligheidstest-/faagscreeningsysteem en Lar Index van antimicrobiële resistentie
Summary
Hier introduceren we het principe, de structuur en de instructie van het intelligente high-throughput antimicrobiële gevoeligheidstest-/faagscreeningsysteem. De toepassing ervan wordt geïllustreerd aan de hand van Salmonella geïsoleerd uit pluimvee in Shandong, China, als voorbeeld. De Lar-index wordt berekend en de betekenis ervan bij het evalueren van antimicrobiële resistentie wordt uitgebreid besproken.
Abstract
Om de efficiëntie van antimicrobiële gevoeligheidstesten (AST) en faagscreening op resistente bacteriën te verbeteren en de detectiekosten te verlagen, werd een intelligent AST/faagscreeningsysteem met hoge doorvoer, inclusief een 96-dot matrix-inoculator, beeldacquisitieconverter en bijbehorende software, ontwikkeld volgens de AST-criteria en de breekpunten van resistentie (R) geformuleerd door het Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI). AST en statistieken van minimale remmende concentratie (MIC)-verdelingen (van R/8 tot 8R) van 1.500 Salmonella-stammen geïsoleerd uit pluimvee in Shandong, China, tegen 10 antimicrobiële middelen werden uitgevoerd door het intelligente high-throughput AST/faagscreeningsysteem. De Lar-index, wat betekent “minder antibiose, minder resistentie en residu tot weinig antibiose”, werd verkregen door het gewogen gemiddelde van elke MIC te berekenen en te delen door R. Deze benadering verbetert de nauwkeurigheid in vergelijking met het gebruik van de prevalentie van resistentie om de mate van antimicrobiële resistentie (AMR) van zeer resistente stammen te karakteriseren. Voor de stammen van Salmonella met een hoge AMR werden lytische fagen door dit systeem efficiënt gescreend uit de fagenbibliotheek en werd het lysisspectrum berekend en geanalyseerd. De resultaten toonden aan dat het intelligente AST/faagscreeningsysteem met hoge doorvoer bedienbaar, nauwkeurig, zeer efficiënt, goedkoop en gemakkelijk te onderhouden was. In combinatie met het veterinaire antimicrobiële resistentiemonitoringsysteem van Shandong was het systeem geschikt voor wetenschappelijk onderzoek en klinische detectie met betrekking tot AMR.
Introduction
Aangezien antimicrobiële middelen op grote schaal worden gebruikt om bacteriële infectieziekten te voorkomen, is antimicrobiële resistentie (AMR) een wereldwijd probleem voor de volksgezondheidgeworden1. De bestrijding van AMR is momenteel de belangrijkste taak van het monitoren van AMR van epidemiologische pathogenen en synergetische therapie van gevoelige antimicrobiële stoffen en lytische bacteriofagen2.
In vitro antimicrobiële gevoeligheidstesten (AST) zijn de steunpilaar voor het monitoren van de therapie en het detecteren van het niveau van AMR. Het is een belangrijk onderdeel van de antimicrobiële farmacologie en de cruciale basis voor klinische medicatie. Het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) van de Verenigde Staten en het Europees Comité voor antimicrobiële gevoeligheidstests (EUCAST) hebben internationale criteria voor ASAT geformuleerd en herzien en de AST-methoden en de breekpunten om de MIC van een bepaalde combinatie van “organisme-antimicrobieel middel” te bepalen als gevoelig (S), resistent (R) of intermediair (I)3 voortdurend gewijzigd en aangevuld; 4. okt.
Van de jaren 1980 tot de jaren 1990 werden automatische instrumenten voor het verdunnen van microbouillon snel ontwikkeld en toegepast in de klinische praktijk, met voorbeelden als Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM en Cobasbact 5,6,7. Deze instrumenten waren echter duur, vereisten dure verbruiksartikelen en hun detectiebereik was ontworpen voor klinische medicatie voor patiënten 5,6,7. Om deze redenen zijn ze niet geschikt voor veterinair klinisch onderzoek en detectie van grote hoeveelheden zeer resistente stammen. In deze studie werd een intelligent AST/faag-screeningsysteem met hoge doorvoer, inclusief een matrixinoculator met 96 dots (Figuur 1), beeldacquisitieconverter (Afbeelding 2) en bijbehorende software8, ontwikkeld om ASAT uit te voeren voor een batch bacteriestammen tegen meerdere antimicrobiële middelen tegelijk door middel van de agarverdunningsmethode. Bovendien werd het systeem ook gebruikt om de lysispatronen van fagen tegen antimicrobieel resistente bacteriën te detecteren ente analyseren 9, en werden lytische fagen efficiënt geselecteerd uit de faagbibliotheek. Dit systeem bleek efficiënt, betaalbaar en eenvoudig te bedienen te zijn.
Figuur 1: Structureel diagram van de 96-dot matrix inoculator. 1: Inoculatie pin plaat; 2: Mobiele provider; 3: Zaadblok; 4: Geïncubeerde plaat; 5: Basis; 6: Bedieningshendel; 7: Limietpin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Constructieschema van de beeldacquisitieconverter. 1: Schelp; 2: Het scherm van de vertoning; 3: Beeldacquisitie ruimte; 4: De basis van de opsporingsraad; 5: Opsporingsraad in en uit pakhuis; 6: Besturingskaart; 7: Het omzettingsapparaat van de beeldverwerving; 8: Lichtbron; 9: Beeldscanner. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De agarverdunningsmethode is goed ingeburgerd en wordt op grote schaal gebruikt. Het principe van het AST-systeem met hoge doorvoer was dat van de agarverdunningsmethode. Een van de cruciale stappen binnen het protocol was de nauwkeurige overdracht met hoge doorvoer van 96 inocula tegelijk, die meerdere keren achter elkaar werd uitgevoerd. Om deze kritieke stap te voltooien, waren de pinnen van de 96-dot matrix-inoculator uniform en zeer glad. De natuurlijke afzetting van elke pin was een volume van ongeveer 2 μL, dat z…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Project (2019YFA0904003); Modern agrarisch industrieel systeem in de provincie Shandong (SDAIT-011-09); Optimalisatieproject voor het platform voor internationale samenwerking (CXGC2023G15); Belangrijke innovatietaken van landbouwwetenschaps- en technologie-innovatieproject van de Academie voor Landbouwwetenschappen Shandong, China (CXGC2023G03).
Materials
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , (2022).
- Yuqing, L., et al. . Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- Liu, Y., et al. A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. , (2019).
- Liu, Y. A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. , (2022).
- Adams, M. H. . Bacteriophages. , (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- . . Shandong veterinary antibiotic resistance system. , (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
